微生物组促进害物抗性的产生和应用
作者：上海市农药研究所 筱禾
1 微生物组(microbiomes)
对与真核生物生态相关并在真核生物中发挥各种功能的细菌、真菌、病毒和古细菌微生物组的研究目前非常流行，尤其是与人类微生物组相关的。最近创建的术语微生物组包括肠道微生物，共生微生物的整体生物群落，表面微生物，根际微生物、根表微生物和根系内生菌等。下文仅就有害生物的微生物组与害物的关系对害物治理的影响，即作为除草剂代谢和杀虫剂抗性的一种模式进行讨论。此外，简要描述了微生物组生物体在作物和有益昆虫中的应用前景，或可用于增强化学合成农药的药效或提高农药选择性。微生物组能够影响农药的作用并不稀奇，已有许多研究记载了人类肠道微生物组如何影响药物功效。
2 微生物可降解农药
在讨论微生物组生物体是否影响害物治理之前，需要强调的是与微生物组无直接相关性的微生物明显具有这种作用。众所周知，微生物降解是环境中农药消解的主要途径。降解速度的不同，在某些情况下会引发问题。30 多年前，当在某种植季为防治昆虫和杂草频繁、大量应用残效较长的土壤处理除草剂和杀虫剂时，出现了所谓的“问题土壤”。这种缺乏长期防治的原因并不是由于有害生物出现了抗性。大多数情况是由于富集的土壤微生物降解了杀虫剂和除草剂。反之，大多数用于抗除草剂转基因作物的基因来源于土壤微生物，通常是从有除草剂残留的土壤中分离所得。苏云金芽孢杆菌菌株在有机农业中用作杀虫剂，其毒素基因被转基因导入许多作物中，通常是叶面定殖生物体，但一般是从土壤中落叶凋落物中分离所得。
3 害物微生物组生物体降解环境异生物质(environmental xenobiotics)
越来越多的报道表明，害物对非商业性杀虫剂类异生物质的抗性不属于害物基因组机制，而是微生物组生物体。下面举例说明。
咖啡因具有很高的杀虫活性，研究人员试图找到造成危害全球咖啡种植园的咖啡果小蠹(Hypothenemus hampei)出现抗性的基因。令他们惊讶的是，无菌(axenic)咖啡果小蠹幼虫很容易被低剂量的咖啡因灭杀，追踪到该基因位于微生物组组合体中的一个特异生物体中，而不是咖啡果小蠹的基因。因为橄榄蝇(Bactrocera olea)幼虫对毒性酚苷橄榄苦苷(oleuropein)敏感，故其应不能存活于橄榄果实。橄榄蝇自橄榄果实表面获得细菌Erwinia dacicola，经由一种尚未阐明的机制使橄榄蝇对橄榄苦苷产生抗性。最近已论述了许多昆虫微生物组的类似情况。同样，松材线虫(Bursaphlenchus xylophilus)不具备降解蒎烯(pinene)的能力，但其在松树中泛滥。这种对萜类降解能力再次源于它们的微生物组。
在生物防治失控的情况下，从夏威夷将甘蔗蟾蜍(Bufo marinus)引入澳大利亚，以防治危害甘蔗的本土 Frenchi 甲虫(Lepidiota frenchi)和灰背甘蔗甲虫(Dermolepida albohirtum)。80 年前，主要使用砷类杀虫剂来防治甲虫。甘蔗蟾蜍头部的毒腺分泌可杀死本土天敌及宠物的心脏毒素(cardiotoxin)，导致本地物种的大量消失。研究人员最近研究了该毒素对蟾蜍卵和蝌蚪或蟾蜍本身没有毒性的原因。他们发现微生物组生物体能够降解毒素，而蟾蜍用这些生物体将卵包裹起来。
据报道，植物也可利用微生物组生物体保护自身免受异生物质影响。例如，根瘤菌雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)可保护苘麻(Abutilon theophrasti)免受由黑麦产生的化感物质——苯并噁唑啉-2(3H)-酮的危害。
4 微生物组生物体降解害物体内农药
考虑到微生物组与寄主互利共生的长期进化史，它们对杀虫剂有相同的作用并不意外。40 年前报道了首例微生物组促进抗性产生，之后被遗忘了30多年。后来有报道，苹果实蝇(Rhagoletis pomonella)微生物组中共生细菌假单胞菌 (Pseudomonas melophthora)能降解 6 种不同的杀虫剂，使这些杀虫剂不能用于防治苹果实蝇。除了1994 年有人提出昆虫内生物体的“共代谢降解”可能是农药快速降解的一个可能原因之外，微生物组促进抗性的可能性大多被忽略。
只有在近 5 年来才有更多的情况被揭露。肠道共生体柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)某个菌株的基因编码的磷酸酶羟化酶可降解橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)体内的有机磷类杀虫剂敌百虫，导致防效下降。同样，危害豆科作物的点蜂缘蝽(Riptortus pedestris)的共生细菌伯克氏菌(Burkholderia)可降解杀虫剂杀螟松，使害虫存活。这些细菌也存在于土壤中，表明它们可能会将对这种杀虫剂的抗性传给其他摄入它们的昆虫。这需要生物体能够在微生物组中确立不被已经存在的生物体所抑制的能力。降解机制尚未深入研究，因此很少或根本没有与杀虫剂交互抗性相关的信息，这对于抗性治理来说非常重要。从小菜蛾(Plutella xylostella)肠道中分离出的多种细菌能够降解杀虫剂茚虫威和乙酰甲胺磷，但还有待证明它们会导致原位抗性。最近已有文章综述了许多此类有关昆虫微生物组的案例。
除草剂禾草灵通常不用于土壤处理，因此以下例子描述非农情况，可能出现的情况。在禾草灵处理后，根际细菌丰度增加，保护了对该药剂敏感的水稻植株。真菌内生菌似乎与多花黑麦草(Lolium multiflorum)对禾草灵的抗性相关，但没有用真菌耐药品系接种植物易感品系的试验数据来证明。
赋予许多已进化代谢抗性的杂草基因尚未被分离或克隆。尽管抗性遗传学并不完全清楚，但这种杂草编码基因实际上并不存在的可能性直到最近才被质疑。这种遗传不是单基因的，其多基因遗传可能由其他因素引起。最近的2项研究发现耐药性杂草的内生真菌数量高于易感种群。多花黑麦草的内生细菌很少，但与对草甘膦的抗性显著相关。已报道在非靶标抗性看麦娘(Alopecurus myosuroides)、硬直黑麦草 (Lolium rigidum) 和草甸羊茅 (Festuca pratensis)中存在内生双分病毒科(Partititiviridae)和弹状病毒科(Rhabdoviridae)的病毒。在测试的任何除草剂敏感生物型植物中未发现看麦娘叶脉曲张病毒1 (AMVV1)，但在耐受种群中的大多数植物中发现了。这 2 种情况下都没有发现任何直接的因果关系，因为尚未向对除草剂敏感的生物型接种这些生物体，以确定它们是否赋予抗性，或者细菌抗生素或抗病毒处理能否消除抗性。
昆虫肠道中含有微生物组生物体，植物具有体表微生物组(根际生物体以及叶片和果实表面的微生物)以及内生微生物组(内生菌)。昆虫和杂草中的更多微生物组能否降解杀虫剂和除草剂有待时间来证明。一种可能性推测是，同样影响微生物自身代谢的农药最有可能首先出现这种进化，如抑制氨基酸生物合成途径的除草剂。进一步假设它们进化后对异生物质具有解毒作用，且不直接影响自身但能挽救其寄主。但这个假设可能有争议，咖啡因、咖啡果小蠹和欧文氏菌的情况就是如此。目前没有这方面的证据支持，也不可能，因为咖啡因能抑制与欧文氏菌近缘的大肠杆菌。如果微生物组生物体产生靶位点抗性，不太可能挽救其寄主。只有代谢抗性或螯合才会使寄主产生抗性。
预测还有一种可能性，即昆虫肠道细菌会产生降解被用作杀虫剂的各种苏云金芽孢杆菌毒素的蛋白酶，因为这些杀虫剂很容易成为这些细菌的营养来源。任何时候一种生物体被一种农药所抑制，很可能会产生抗性，而已知这些 Bt 毒素可影响昆虫肠道内的微生物群落结构。
其中一些微生物组促进的抗性可能遗传，因为细菌会从母体传播至害物的卵或种子表面。确定抗性是来自害虫基因组还是微生物组基因组的最简单方法是使用无菌害物，或用抗生素处理害物，并观察抗性是否保持不变。上述抗性不符合抗性应是害物基因组内遗传的传统定义。由于田间的这种防治失效(lack of control)不符合抗性定义，有人提议将定义修改为包括其他类型的防治失效。对种植者来说，肯定无法理解由微生物组引起的防治失效不是抗性。这个例子说明内吸性杀菌剂和抗菌化合物可作为农药增效剂来预防或克服微生物组促进的农药抗性。
癌细胞可被视为有害生物，或者至少与它们类似，而抗癌药物即等同于农药。令人惊讶的是已经观察到一些癌细胞的胞内细菌微生物组可降解抗癌药物 2\&\#39\;,2\&\#39\;-二氟脱氧胞苷(2′,2′-difluorodeoxycytidine)，导致耐药性。通过给予抗生素和化学治疗剂来克服这种耐药性。
有一种可能性假设，即一些原因不明的啮齿动物对抗凝血杀鼠剂的抗性源于微生物组。微生物组通常为哺乳动物提供抗凝血剂的解毒剂——维生素K。富含维生素K的生物体可能会赋予抗药性。利用抗生素压制应用抗凝血剂 warfarin 病人的肠道生物群常常会导致这种抗凝剂的过量，危及生命。将应用高剂量抗凝血剂 warfarin 的人的排泄物饲喂小鼠，小鼠会产生 warfarin 耐药性，表明了由排泄物摄入引起啮齿动物对抗凝血剂产生抗性的一种可能
途径。
目前有关微生物组促进抗性产生的报道很少。人们在杂草和昆虫基因组学、转录分析和代谢组学方面投入了大量精力，但代谢抗性的许多案例的确切原因尚未阐明。也许这要归咎于研究的是有害生物的而非微生物组的基因组、基因及其产品。
寻找抗性基因的第一步，往往是从抗性与敏感个体的转录组分析开始，观察哪些基因在抗性害物中产生了差异化的 m RNA。粗RNAs是从两者中提取的，然后过亲和柱将结合m RNAs poly (A)尾巴的害虫 m RNAs 从其余的RNAs中分离出来。然后对这些poly (A)m RNAs进行洗脱和分析。有一个可能的问题，即只有真核m RNA具有一个ploy (A)尾巴，因此细菌、病毒、线粒体和叶绿体的转录体 m RNA在分析中被丢弃。
现在的研究方法保留了non-poly(A) m RNA。目前有几种从害物中分离微生物m RNA的方法，包括商业试剂盒，本文旨在提醒读者在农药抗性情况下这样做的必要性。
5 微生物组生物体赋予抗性在作物中的应用和益处
令人怀疑的是，自然发生的内生细菌和/或真菌本身是否能赋予寄主对异生物质产生足够的抗性。那些可能有用的微生物是典型特异性物种，而不是需要耐受性的物种。其他种类对农药的降解速度不够快，无法产生抗性。例如，将一个编码甲苯降解途径基因的质粒从没有定殖于黄羽扇豆的伯克霍尔德菌(Burkholderia)菌株转移到定植的菌株上，“明显”降低了甲苯对植物的毒性。显然，在存在甲苯土壤污染问题的情况下，还有更多的事情要做。这些问题很有可能通过基因工程，提高微生物的降解性能而得到解决。
多个研究团队已经验证了降解农药的生物体赋予昆虫耐药性的可能性。在杀虫剂处理前，向模式昆虫果蝇饲喂与有机磷杀虫剂对硫磷和毒死蜱结合的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，果蝇则对这 2 种杀虫剂具有一定的抗性。有一种感染蚜虫的内共生体的溶原性噬菌体，可保护蚜虫不受寄生蜂的侵害。这种噬菌体与感染其他微生物组共生体的噬菌体密切相关。可以设想这种噬菌体可被用来感染有益昆虫的微生物或将其基因转入这些昆虫，在昆虫体内表达产生内源性噬菌体。在一项专利申请中(目前还不清楚是否有实际证据表明已经做到了这一点)也提出，蜜蜂和其他理想昆虫的微生物组生物体可被设计用来降解新烟碱类杀虫剂。
某些植物假单胞菌菌株和种能产生抗菌、杀菌和杀虫的化学物质。近来有人建议更广泛地使用这些物质，特别是用于害虫防治。尽管它们被宣传为环境友好和天然的，但不能保证它们制成的化学品是安全的，而且据推测，管理机构将会像审查化学合成农药一样对它们进行审查。侵染番茄的假单胞菌可使寄生杂草埃及肉蓰蓉(Phelipanche aegyptiaca)的萌发率降低 80%。这种杂草每株即能产生数以万计的种子，因此该菌目前还不足以用于害物治理。尽管如此，可以通过基因工程增强这种假单胞菌的毒性，使其发挥更大的作用。
在最近的一篇综述中，对利用基因工程改造内生菌赋予植物除草剂抗性的可能性进行了大量的讨论，列举了可用于开发新除草剂抗性体系的无数具体代谢体系和基因的实例。
有 2 种人工将内生菌引入作物用于大规模农业的方法。一种方法是利用高压将内生菌引入种子。这种方法被用于向玉米引入一种可生成具杀虫活性Bt 毒素的基因工程改造内生菌。在多年/地点的田间试验中，该处理可使玉米螟的危害下降2/3 左右。由于防效带来的产量增加不足以弥补成本，这种方法与杀虫剂不存在竞争性。另一种接种方法是向植物的花喷洒接种体引入内生菌，且转基因标记存在于后代中。目前还没有害物治理相关基因利用该技术进行了试验的报道。
似乎更容易将微生物组生物体应用于昆虫，无论是直接用于卵或是幼虫。
6 结 语
显而易见，一些研究害虫对环境异生物质和杀虫剂的抗性进化的研究人员已经重现了 Pasteur 和Lister 的研究，需要了解微生物作用和无菌系统的重要性。人们常常认为，如果将植物、啮齿类动物或昆虫组织研磨后研究代谢，所阐明的代谢途径即是这些生物代谢的结果。很少有研究人员会检查微生物污染，或者用无菌害物来确定抗性是否确实属于害虫自身，而不是它的微生物组。微生物组生物体的种群密度时高时低，类似于可随着选择压力的增加而增加的表观遗传抗性，在后代中偶尔会被“遗忘”，可能导致被误认为偶发(sporadic)抗性。同样，一 些 研究人员没有遵循柯赫氏假设 (Koch’s postulates)，将有微生物组和无微生物组的物种个体间的代谢差异与微生物组联系起来。无需侵染无菌菌株，已用抗性个体的微生物组进行了研究，以确定它们是否获得了这种性能。
过去，研究人员不想发表孟德尔遗传学无法解释的偶发抗性案例结果。因此造成了对某些由表观遗传因素引起的抗性的认识滞后。期望现在已没有了这种想法，那么，人们会看到更多有关微生物组抗性的报道，即使它不符合对抗性的现行定义。
尽管存在上述弊端和限制，但似乎有大量证据表明，某些对异生物质和农药的抗性来源于微生物组，从事害物治理的科研人员应该意识到这种可能性。有证据表明，微生物组生物体在胁迫条件下的种群密度更大。考虑到气候的波动和变化所带来的胁迫，可能会看到更多受微生物组影响的抗性。就像可利用抗生素同时治疗来防止哺乳动物肠道或细胞内肿瘤微生物组对药效的不利影响一样，可设想在害虫微生物组中能发现和开发防止农药代谢的增效剂。
利用微生物作为生物防治剂来保护农作物免受害物危害还处于一个较长的起步阶段，前景光明，但目前还没有准备开展大规模的田间推广。大多数商业化的生物防治剂的应用仅限于条件可控的温室。如何增强它们的毒性，在种植体系中保持所接种有益微生物组的稳定种群，并制备有效的制剂，使它们能够在田间得到有效利用，任重道远。
