韩方普研究组在CRISPR-Cas9玉米基因组编辑方法研究中取得新进展

基因组编辑是生命科学新兴的技术并被迅速在每个实验室应用，特别是基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑工具近年来发展较快，在医疗、农业等领域展现巨大的应用潜力。然而此前，在玉米等部分作物中基于农杆菌转化的载体进行基因组编辑的效率偏低，在一定程度影响到该技术的高效利用尤其是基于CRISPR-cas9系统的高通量突变allele筛选。因此，如何提高编辑效率是大家关注的问题。另一个非常关键的问题是如何降低脱靶或不脱靶，这也是实际应用的限制因素。

中国科学院遗传与发育生物学研究所韩方普实验室前期选择了若干玉米减数分裂特异基因的启动子用于驱动Cas9基因的表达，希望在配子中实现高效的基因组编辑，从而在T1代获得大量纯合或双等位的突变体。其中用到的一个为玉米DMC1基因启动子，构建了DPC（DMC1 promoter-controlled） CRISPR-Cas9载体系统，用该载体系统转化玉米幼胚后，结果意外发现：凡是抗性愈伤组织靶位点均发生基因组编辑，另一个非常有趣的结果是：T0代植株中出现60-70%左右的纯合或双等位的突变体，其余为杂合或嵌合的突变体植株。并且这些纯合或双等位突变体植株(再生自一个抗性愈伤组织)含有不同的突变allele类型。通过对多个基因靶点（包括一个标记基因zb7，突变能产生白化的表型）的编辑实验，验证了该载体系统的高效性（下图为对玉米zb7基因靶点的编辑）。这一技术对韩方普研究组研究细胞分裂突变体的基因功能提供了非常快速高效的方法，当代纯合或嵌合突变体就可以直接观察细胞学及染色体行为与功能。此外，也证实了产生的突变能够稳定遗传到T1代，并且新的突变allele类型在T1代也被发现。通过全基因组测序分析，在预测的1000多个潜在脱靶位点没有发现脱靶突变。由于DMC1基因在进化中非常保守，该基因的启动子也可能有潜力在别的植物中发挥类似的作用，虽然科学家在小麦中的初步尝试结果不甚理想。

该研究成果于2018年3月23日在线发表于Plant Biotechnology Journal杂志上（DOI:10.1111/pbi.12920）。韩方普研究组博士生冯超为该论文的第一作者，该研究得到转基因重大专项及科技部育种专项的资助。

图：利用DPC CRISPR/Cas9系统编辑玉米zb7基因

A. zb7基因结构、靶位点和DPC CRISPR/Cas9 载体模式图； B. 编辑zb7基因获得的T0代植株表型； C. 部分T0代突变植株基因型鉴定的结果。