《科学》！麻省理工张锋最担心的事情发生了：取代CRISPR基因编辑新方法！以色列打开寻找新的基因编辑工具大门
发表日期：2018-02-04 01:35AM 阅览次数：
引言：最新一期国际著名医学期刊《科学》杂志发表了一篇重磅研究，一组来自以色列的科学家在细菌体内发现了新的10种免疫防御系统，这些新系统将为开发新的基因编辑工具带来希望。
在微生物面前，人类还是一个自以为是的小孩子！
细菌在几十亿年之前就已经在地球上面生存，几十亿年的进化让细菌在地球上大获成功，如今，细菌无处不在，空气、水、土壤、动植物身上都有细菌的身影！
细菌在地球上持续攻占了山川河流、植物、低等生物、甚至恐龙、哺乳动物，最后攻占了人类的肚子！
是的，人类从出生那一刻开始就注定和细菌携手一辈子！（见本公众号原创文章Nature！胎儿到底有没有细菌？）
别以为人类了不起，若是没有细菌在你肚子里面玩耍，你要想愉快地生活那是绝对不可能的！如今的微生物研究可以揭示一定的道理：你需要伺候好你肚子里面的细菌，否则它们要是闹腾起来，你的整个身体运转恐怕会出问题！
▲艺术家设计的一种模拟细菌培养皿中绘画艺术（图片来自网络）
看到这里，是不是以为颠覆了你的想象？这是一个细菌统治的世界！
▶噬菌体的进攻◀
然而，好就好在这个地球有一个所有的物种都逃不过的自然规律，那就是：相生相杀！这正是我们中国的古话说的：一物降一物。
这正是生态平衡的概念！自然界的一切都是维持生态平衡，你细菌若是强大到无人能敌，强大到肆掠地球，无法无天，那还得了？因此，细菌也有天敌！
细菌的天敌是什么呢？那就是号称噬菌体（phage）的简单生物：仅由一条核酸和外壳蛋白质组成。
▲噬菌体外形（模拟图），紧紧附在细菌的表面
噬菌体的外形貌似科幻电影中的外星生物，一个大脑袋加八角蜘蛛一样的脚，一旦附着在细菌表面（不同的噬菌体针对不同的细菌），就将自己的核酸注入细菌，然后裂解细菌，复制自己。
因此，可以说细菌是噬菌体的“猎物”。
有了噬菌体，细菌就不敢到处嚣张了（当然，且不提抗生素的强大作用），也不敢占领一切了。
▶细菌的反击◀
但是，你以为这就是故事的结尾，那就太不懂相生相杀的套路了。
举个不严谨的例子，比如刺猬是豹子的猎物，但是人家刺猬在漫长的被猎杀的过程中，渐渐进化出了又长又硬的刺，几万年以后，你豹子的后裔要想再吃刺猬，那就不容易了，你以为那尖尖的刺是你嘴巴上的肉能够对付得了的？
因此，这里也一样，你噬菌体要杀我细菌，我细菌就在漫长的岁月中进化出了防御系统，专门用来对付噬菌体。
目前，最出名的细菌防御系统就是CRISPR-Cas系统。CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列，分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。
▶细菌的免疫系统◀
正如前面所言，每一种噬菌体专门猎杀某一种细菌，因此，某一种类的细菌就进化出专门对付特定噬菌体的防御系统。所以，不同种类的细菌进化出多种多样的防御系统。
众所周知，目前火热异常的第三代基因编辑技术是由CRISPR系统改造而来，而CRISPR系统则仅占整个目前已经测序的细菌的40%左右，那么，其他的细菌种类靠什么方式来防御噬菌体呢？
▲附着在细菌表面的噬菌体的电镜照片，可以看到许多噬菌体（图中许多白色的“脑袋连着尾巴”的是噬菌体）正在攻击细菌（图片来自网络）
换句话说，目前都发现有哪些细菌的免疫系统呢？
除了上面所说的CRISPR系统之外，目前还发现【1】：
R-M系统：restriction-modification (R-M) systems；
Abi系统： abortiveinfection systems (Abi)；
BREX系统；
pAgos系统：prokaryotic Argonautes (pAgos)；
DISARM系统
其中，目前已经知道，CRISPR系统占整个目前已经测序的细菌的40%左右；R-M系统则更广泛，在75%的原核生物基因组中均被发现；而BREX系统和pAgos系统加起来则在10%原核生物基因组中能观察到【1】。
细菌的种类万万千千，人类发现的细菌或者已经测过序列的细菌可以说是地球上细菌中的一小部分，因此，是否还存在其他的细菌免疫系统呢？
▶研究过程◀
这正是以色列Weizmann研究所的分子遗传学家Rotem Sorek带领的研究团队想干的事情。
该研究团队在最新一期《Science》上面发表文章，发现了细菌的10种新的免疫系统，这些新系统的深入揭示，会为开发新的基因编辑工具带来帮助。
▲研究者们在著名学术期刊《科学》杂志上发表的文章，这张截图是不是相当喜庆呢？小编可是等了好久才等到这条Science上面跳出来的广告，于是赶紧截下来，希望能够召唤关注本公众号的一众海外大咖以及你们的徒子徒孙赶紧回来报效国家同时成就自己更大的未来（图片来自Science）
研究者们是怎么发现的呢？或者说采用什么方法发现的呢？
这得看一看设计思路。总的来说就是通过已知基因发现未知基因。
那么，怎么通过已知基因发现未知基因呢？研究者们设想，细菌的免疫系统抗击噬菌体往往不会一个防御基因（defense gene）单独行动（比如Cas9或者某个限制性内切酶），而可能是一大堆临近的基因家族一起行动，这样一来，已知某个抗击噬菌体的基因之后，在这个基因的周边或者离这个基因不远的基因组位置上，也必定存在其他的这个基因家族相关的防御基因。因此，只需要把不同的细菌的基因组放在一起来进行序列比对，就能发现序列同源的基因，最后再把临近的同源基因拼接起来，就能够组装成候选的细菌免疫系统了。
▲研究者们采取的获取候选细菌免疫系统的方案示意图，黄色代表已知的防御基因（defense gene，比如Cas9、一些限制性内切酶等），而在这些已知的防御基因临近的位置，可能存在一些未被发现的防御基因，因此，通过不同的细菌基因组的序列比对及组装拼接就能够获得候选的细菌防御系统
实际上，说起来你可能感觉非常复杂，然而，看看上面的图你就会一目了然，事实上，熟悉的人就知道，就是序列比对然后拼接基因组那一套类似的方法。
当然，在这里我们也不要过多纠结于生物信息学分析了，大多数人还是喝不了程序狗们这碗难喝的汤！
难怪现在看到实验室招聘最火爆的职位就是Bioinformatics Engineer。
那好，过程看得糊里糊涂的，那就在下面一节看看结果吧！
▶发现10种新系统◀
研究者们从大于45000个已知基因组序列的细菌及古细菌的超过1.2亿个基因的14083个蛋白家族中进行筛选，结果筛选到335个候选基因家族，这些候选基因家族可能就是细菌的免疫系统基因家族。
▲研究者们进一步采取策略在两种免疫缺陷的细菌中筛选候选基因家族
因此，研究者们将要进一步在缺少免疫系统的大肠杆菌菌株str. MG1655以及枯草芽孢杆菌菌株str. BEST7003（类似缺少免疫系统的小白鼠）中进行检验，把这些候选免疫系统基因加入到缺少免疫系统的上述两株细菌中，然后加入噬菌体，观察能不能抗击噬菌体的杀伤，若是能够抗击噬菌体，那么，这个候选免疫系统就是真正的细菌免疫系统了，相反，若不能抗击噬菌体，则表明导入的这个候选基因家族不是细菌免疫系统。
▲领导这项研究的Rotem Sorek博士
此时估计这些研究者们傻了眼！为何？因为一共有335个候选基因家族，若是合成这些基因的序列，那可是相当昂贵啊，估计此时此刻Rotem Sorek博士作为实验室老板的心是崩溃的，合成这些序列这么多钱，不是逼着我关门吗？
确实，虽然你Rotem Sorek小鲜肉博士长得细皮嫩肉，风流倜傥，但是也不能当饭吃，更不可能把长相当钱用，不信你就走到基因合成公司去刷一下脸，看他们公司能不能给你降价合成序列甚至免费送你。若是刷脸都能解决钱的问题，那小编得活的多开心（开个玩笑）。
于是，疯狂地通过各种各样的方法砍掉三百多个候选基因家族，只留下28个！
这回终于不用花太多钱了（开玩笑），于是开始做实验，结果最终筛选到10个新的细菌免疫防御系统（如下表）。
▲研究者们发现的10个新的细菌防御免疫系统，采用各种神话人物来命了名
当然，研究人员还研究了其中几种系统，在此不再详说。这10种系统中有9种都是抗击噬菌体的，有一种是抗质粒系统。
▶为新的遗传工具提供可能◀
不要忘了现在如火如荼的第三代基因编辑技术CRISPR-Cas系统的发现历史，也是源于细菌的CRISPR免疫系统的分子机制的阐明。而第二代基因编辑技术TALEN技术则来源于植物病原体黄单胞菌属的avrBS3蛋白特异核酸序列结合特性。
事实上，许多工具酶都是人类从细菌偷师而来，这也正是细菌的伟大之处。你花费一生越过山丘，苦苦追寻答案，而大自然早已经把答案深埋在细菌之中，只为等待一双发现的眼睛。
“我们发现的系统与之前所见过的不同，“Sorek说， “但其中我们认为，有一两个可能有增加基因编辑工具箱的潜力，还有一些指向人体免疫系统的起源。”
小编深刻地经历过第一代基因编辑技术锌指核酸酶ZFN技术的爆发到如日中天，再到少有问津，第二代基因编辑技术TALEN的爆发，再到衰弱，直到第三代基因编辑技术的爆发，如今应用已经极其广泛。
有没有更好的基因编辑技术？人们一直都会问！科学家们也一直苦苦追寻，谁又能够一定确定未来基于CRISPR-Cas系统的技术不会被取代呢？
这也许正是张锋这群人所担心的！就像打败银行的并非几个大银行本身，而是来自于全新的对手！
参考资料：
1. Systematic discovery of antiphagedefense systems in the microbial pangenome.
2. https://wis-wander.weizmann.ac.il/life-sciences/bacterial-immune-systems-take-stage
