元英进等Chem Soc Rev综述酿酒酵母染色体人工合成的技术和方法

DNA测序技术的迅猛发展，使得我们可以比以往任何时候都更加方便地“阅读”生物体的遗传编码序列，但是很多复杂生命信息很难单纯通过DNA测序获知，如果能够人工合成染色体，实现DNA认知从“阅读时代”到“书写时代”的转变，将有助于对复杂生命现象的理解。近日Chem Soc Rev杂志刊登了天津大学元英进教授等撰写的综述文章，详细阐述了酿酒酵母染色体人工合成的过程。

图1 人工合成酿酒酵母染色体过程

人工合成原核生物支原体及大肠杆菌基因组的工作已有报道。但是酿酒酵母作为真核模式生物，由于染色体结构复杂等原因，基因组的人工合成尚未完全实现。研究人员基于“设计—构建—检验—纠错—学习”循环实现了酿酒酵母染色体的人工合成：

设计环节，研究人员根据目的需要制定了以下3大原则：1、功能存活性，即合成型染色体菌株与野生型菌株具有相同或相似的生长表型与适应性；2、遗传稳定性，剔除、重置导致基因组不稳定的DNA元件；3、操作柔性，在非必需基因后插入无方向性loxP位点从而赋予合成型染色体一定的灵活性，预留进化空间。在计算机帮助下，研究人员可以加速完成序列的设计环节。

设计完成后是构建，采用“自下而上”的方式。即首先合成约70 bp长的寡核苷酸，然后组装成约750 bp长的“组装砖块”（buildingblocks），再合成2‒3 kb的更大模块，采用同源重组的方式，逐步替换酿酒酵母内源的染色体序列（图 2A）。为了加速这一进程，也可以平行替换染色体的不同区域得到半合成型染色体，然后利用减数分裂过程中的同源重组和姐妹染色单体的交叉互换，快速得到野生型染色体全替换版本（图 2B）。为了将平行合成的不同染色体集中到一个细胞中，还可以利用图 2D方法，即首先融合生成二倍体再拆孢得到单倍体，获得全是合成染色体的单倍体细胞。

图2 典型的构建过程

检验环节主要包括基因型检验和表型检验。基因型检验方面，开发了快捷有效的“PCRtags”分析方法，即通过引物设计区分合成型序列和野生型序列。基因型测试还采用PFGE、southern blot、全基因组测序等方法。表型测试方面，使用了一系列不同条件测试菌株生长、有丝分裂稳定性等指标。还测试人工合成染色体相比于野生型染色体在转录组、蛋白质组、代谢组等方面的异同。除此以外还借助结构生物学手段，分析比较了人工合成染色体在三维结构方面同野生型的构象是否有差异。即使人工合成染色体经过上述精心设计、构建和检验环节，仍然不可避免的有一些错误（bug）。通过基因型‒表型关联、PCRtags分析、全基因组测序等找到错误碱基，采用诸如CRISPR等技术实现纠正。

酿酒酵母染色体的人工合成，表明我国在该领域已经实现了与美国的共同领跑。在科学意义上，加深了我们对酿酒酵母这一重要模式生物的认识。特别地，合成型酵母染色体上预留的菌株进化空间，可挖掘用于医学、工业方面的基因靶点，或者性状优良的工业菌株的开发。

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