精确制导，安全提升，基于靶向表观遗传治疗的新一代CRISPR/Cas9技术

基因编辑技术——尤其是CRISPR/Cas9技术——的迷人之处在于，能够高效地在特定位点插入或移除基因，或修复致病基因突变。然而基于CRISPR/Cas9的常规基因编辑技术在应用到疾病治疗上时，人们会有多种顾虑。这些顾虑主要包括DNA链在被切开然后修复的过程中引入未知的突变、脱靶和基因表达量的不可控等。

12月7日，Cell在线发表了来自美国Salk生物研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte课题组题为“In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation”的研究论文，报道了一种经过改良的CRISPR-Cas9技术，能够特异性改变疾病相关基因的活性，而非其对应的序列。研究人员还展示了这项技术可以用于治疗包括肾脏、肌肉和胰岛素产生功能损伤等在内的小鼠疾病模型，为将来更好的用于治疗人类疾病奠定了良好的基础。鉴于该工作在未来可观的临床应用前景，BioArt特别邀请到了中科院神经科学研究所杨辉研究员进行了精彩点评，以飨读者！



该论文的通讯作者Juan Carlos Izpisua Belmonte表示，“DNA剪切可能会造成新的突变，无论是CRISPR还是任何其他DNA剪切技术，都存在这个隐患。这是遗传学领域面临的主要瓶颈：细胞在DNA剪切后可能引入新的危害”。

针对上述问题，Belmonte实验室对CRISPR-Cas9系统进行了改造，其目的不再是切割DNA而是可以通过表观编辑技术（epigenetic editing technology）在保证DNA完整性的基础上特定激活基因的表达，并且能够在小鼠体内产生表型。

事实上，过去早在2013年就有一些报道利用dCas9-VP64 系统激活特定基因的表达【1,2】，当初更多的只是利用单个sgRNA，然而对于基因激活来说更多的是需要多个sgRNA来完成，后续也有相关的技术改进（例如：tripartite activator system [dCas9-VPR], synergistic activation mediator [SAM], or dCas9-Suntag），甚至还有第二代【3】。但是总的来说，运用上述技术进行体内生理功能（有表型）方面的研究仍然没有得到很好的展开。

这项技术的核心是：首先筛选到了最核心的转录激活复合物组合MS2:P65:HSF1（MPH）；然后设计出包含两个能够招募MPH转录激活复合物的MS2域以及含有14bpRNA的dgRNA；最终在借助AAV病毒作为引导工具的条件下激活靶向基因（下图）。（说明：大多数CRISPR-Cas9技术都使用的标准20个核苷酸，而短sgRNA仅有14或15个核苷酸，这就能防止Cas9切割DNA。）



Belmonte 实验室基于上述策略，在好几种小鼠疾病模型中都能逆转疾病的发生，例如急性肾损伤小鼠模型与1型糖尿病小鼠模型，此外该团队还使用该技术可以让肌营养不良症的小鼠恢复肌肉生长和肌肉功能。

上述过程并没有利用CRISPR-Cas9系统试图纠正突变的基因，而是增加与突变基因相同途径的基因表达，令其表达效果超越受损基因的表达效果。也就是所，突变的的基因依然存在，但是可以藉由相同的通路恢复其它基因的表达，这足以恢复突变小鼠的相关功能。



初步实验数据表明，这一技术是安全的。不过，将其用于临床之前，研究人员还需要进一步研究以确保安全性、实用性和功效。

Belmonte认为这项技术有潜力治疗阿尔茨海默病和帕金森病等神经疾病。正如该技术在小鼠身上能恢复肾脏、肌肉和胰岛素相关功能的损伤，他相信有一天人类患者的神经细胞群也能再生。

专家点评：

杨辉（中科院神经科学研究所PI、国家“青年千人”）

Comments：Belmonte团队这项工作阐述了应用CRISPR/Cas9 激活体统治疗疾病这个概念。我认为这项工作最吸引人的地方就是提出了“targeted epigenetic therapies”这个概念，并在几个小鼠疾病模型中得到验证。CRISPR/Cas9 介导的体内激活相比于传统的AAV介导的基因过表达来说，更加“Nature”和更安全，而且不受基因大小限制。相比于 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除来说，不造成DNA双链断裂，更可控。我认为这一系统另外一个潜在应用就是精确调控基因的表达量，来研究复杂的生命过程。比如脑发育重要的一些基因，Mecp2和Shrank3等，基因表达量高了和低了都会造成疾病。另一个潜在应用就是同时调控多个基因的激活或抑制。

参考文献：
1.Perez-Pinera, P., Kocak, D. D., Vockley, C. M., Adler, A. F., Kabadi, A. M., Polstein, L. R., ... & Guilak, F. (2013). RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature methods, 10(10), 973-976.
2.Maeder, M. L., Linder, S. J., Cascio, V. M., Fu, Y., Ho, Q. H., & Joung, J. K. (2013). CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature methods, 10(10), 977-979.
3.Komor, A. C., Badran, A. H., & Liu, D. R. (2016). CRISPR-based technologies for the manipulation of eukaryotic genomes. Cell.



Juan Carlos Izpisua Belmonte教授

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