中科大孙宝林课题组：III型-A CRISPR-Cas系统改造耐药金黄色葡萄球菌的基因组

CRISPR-Cas系统是古细菌及其他细菌的获得性免疫系统，是细菌为了抵御外源基因入侵而形成的自我保护机制。根据CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins ,cas）的结构和功能，将为CRISPR-Cas系统分为5个类型，其中I 型、 II型和III型CRISPR-Cas系统最近研究较多。已有研究表明III型CRISPR-Cas系统由9个cas蛋白（包括cas和csm）和间隔序列（spacer）组成，其中Cas10是参与crRNA的成熟和剪切入侵外源DNA的特征蛋白。孙宝林课题组在之前研究发现6株临床分离株（S. aureus AH1, AH2, AH3, SH1, SH2, 和SH3）含有III型-A CRISPR-Cas系统，且对系统中重复序列研究发现它们具有较高保守性。此外，与I 型和 II型 CRISPR-Cas 系统较大不同， III型CRISPR-Cas系统不需要PAM（protospacer adjacent motif）序列，但其crRNA 5’-tag序列（ACGAGAAC）发挥着同样的作用。孙宝林团队便利用其中一种社区获得性耐药金黄色葡萄球菌（S. aureus AH1）自身所具有III型-A CRISPR-Cas系统来设计实现对其基因组进行剪切。

孙宝林团队先通过截断CRISPR的先导序列（leader sequences）确定基因组中CRISPR的启动子区，再将此片段、保守的重复序列与靶向金黄色葡萄球菌mec基因盒的间隔序列组装成CRISPR质粒。再利用S. aureus AH1所具有的cas蛋白和体外设计的CRISPR质粒,对中基因组中mecA基因进行靶向剪切。研究者对间隔序列的长度和方向与靶向性的关系进行研究，表明间隔序列在33bp和36bp时靶向效率可达99%，并证明了III型-A CRISPR-Cas靶向编码序列。并对crRNA 5’-tag序列进行不同的突变，证明crRNA 5’-tag与原型间隔（protospacer）临近序列有三个连续的配对，将会大大的降低基因的靶向性，这也是含有III型CRISPR-Cas系统的细菌用来识别自己和外源序列，防止剪切自身序列的机制。此外，他们将存活的转化子进行分析，发现有87.5%是靶点被删除，10.2%是cas基因发生了突变，2.3%是CRISPR质粒中的间隔序列被删除（如图1）。

图1 存活转化子突变分析

研究者系统的研究了金黄色葡萄球菌的III型CRISPR-Cas系统在基因组靶向剪切中的CRISPR质粒各种参数，使得靶向效率提高。在对存活转化子分析中发现S. aureus AH1具有具有较大概率（87.5%）自我修复功能，且同时发生大片段的基因缺失，因此，用此方法用于耐药菌株中耐药基因或致病基因的敲除是大有希望的。

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