重磅!NCI科学家首次揭秘CAR T细胞体内扩增和持久性的奥秘

目前，靶向CD19的CAR-T细胞已经在复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者中表现出了有效的抗癌活性，在多个临床试验中都具有高缓解率。然而，仍存在大约10％至20％的ALL患者和50％的淋巴瘤患者没有获得缓解。此外，更长时间的随访表明，在没有进一步巩固治疗的情况下，绝大部分患者的缓解并不能长期维持。

由于CAR T细胞的输注剂量非常小，需要在体内进行扩增反应，所以扩增的数量达不到会影响患者最初的缓解情况。此外，接受CD19 CAR T细胞治疗后获得初始缓解的ALL患者的复发与CAR T细胞的丢失相关。因此，更好地了解影响体内CAR T细胞扩增和持续性的因素有可能提高患者的应答率和缓解持久性。

众所周知，CARs是合成构建体，当其引入到成熟T细胞时，除了内源性T细胞受体(TCR)外，还赋予了第二种非主要组织相容性复合体(MHC)限制的特异性。然而TCR活化对CAR T细胞有效性的影响尚未明确。

虽然关于嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的研究很多，但大多数临床前研究都是使用转导的人T细胞在免疫缺陷型小鼠中进行测试，以评估临床产品。然而，人类细胞上的内源性T细胞受体(TCRs)不能被小鼠MHC中存在的肽激活。

为了确定TCR的参与对CAR活性的影响，Yang等人(Yinmeng Yang)在免疫活性小鼠中使用了一种靶向CD19的CAR以及多种类型的转导T细胞。结果发现，TCR识别出CD8 CAR T细胞暴露的抗原，从而导致了T细胞耗竭、凋亡并使其失去效力。但这种现象并没有在CD4 CAR T细胞中观察到。该研究表明了对T细胞的生物学特性的深入了解可以进一步改善CAR-T细胞疗法的有效性，提供了CAR T细胞疗法生物学重要方面的见解，并指出合理设计CAR构建体以优化临床效力的机会。

在此次实验中，研究人员使用针对前B细胞急性淋巴细胞白血病的靶向CD19的CAR T细胞疗法的同源小鼠模型，将CAR引入具有已知TCR特异性的T细胞中，研究证明：当TCR抗原存在时，CD8 CAR T细胞效力丧失，而这与细胞表面增加的耗竭和凋亡标记物相关。

CD4 CAR T细胞则表现出与CD8 CAR T细胞相当的细胞毒性。但相反的是，尽管由TCR刺激，CD4 CAR T细胞仍能保持在体内的有效性。与CD4受体T细胞相比，基因表达谱证实了CD8 CAR T细胞在双重受体刺激下耗竭和凋亡的增加，并且表明CD4和CD8 CAR T细胞在T细胞相关信号通路间的固有差异。

▪ CAR4和CAR8细胞在体外和体内针对ALL的有效性和持久缓解具有可比性

TCR介导的异种GVHD(移植物抗宿主病)和宿主免疫缺陷损害了异种移植模型中CAR T细胞生物学的系统评估。在此项研究中，科研人员使用了临床上相关的CD19 +B细胞前体急性淋巴细胞白血病(pre–B cell ALL)同源小鼠模型，其能够导致免疫活性小鼠快速致死，但可以被靶向CD19的具有CD28共刺激结构域的第二代CAR转导的T细胞消除。

用这种鼠CD19 CAR(分别为CAR4和CAR8细胞)转导纯化的CD4 +和CD8+T细胞显示出相当的抗CD19 + ALL的体外细胞毒性(图1A)。在体外与CD19 + ALL共培养时，CAR4细胞产生了高水平的IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6和IL-4。相反，CAR8细胞则产生了更高水平的免疫抑制性细胞因子IL-10(图1B)

在白血病细胞接种后第4天，CAR4和CAR8细胞的1：1混合物有效地介导体内肿瘤清除和存活(图1C)。而单独输注的CAR4和CAR8细胞在治疗剂量下对抗ALL也是同样有效的(图1C)，并且在非固定剂量下延迟白血病进展是等效的。然而，与纯化的CAR4细胞相比，纯化的CAR8细胞在+7天显示出增强的扩增。另外，在CAR4 / CAR8 1:1同时给药后，CAR8细胞优先扩增。(图1E)

也就是说，CAR4细胞表现出与CAR8细胞相当的抗白血病活性并产生更高水平的免疫刺激性细胞因子，但在CAR8细胞存在的情况下，CAR4细胞的扩增减少。

▪ CAR4能够在TCR和CAR抗原的存在下保持体内活性，但CAR8细胞不能

CAR的引入使T细胞具有双重抗原特异性，在临床试验中使用保留的TCR特异性来促进病毒特异性CAR T细胞的扩增，但是CAR T细胞的双重激活对抗肿瘤效力的影响尚未在免疫活性临床前模型中进行评估。

为了确定内源性TCR信号传导对体内CAR T细胞功效的影响，研究人员将来自女性供体的HY特异性CAR4和CAR8细胞转染给带有白血病的雄性(HY +)和雌性(HY-)小鼠(图2C )。结果表明，HY特异性CAR4细胞根除了所有小鼠体内的白血病细胞，存活时间超过100天。相比之下，HY特异性CAR8细胞清除了雌性小鼠体内的白血病细胞，但存活时间并没有延长存活(图2D)。

而且在第7天和14天，用HY-特异性CAR8细胞处理的雄性小鼠中证实了CD19 +白血病的进展。总之，这些数据表明CAR T细胞保留了通过内源性TCR应答抗原的能力，但是通过TCR的信号传导损害了CAR8细胞在体内消除白血病的能力，暴露了CAR4和CAR8细胞之间固有的生物学差异。

▪TCR抗原的存在降低了CAR8细胞的数量，与细胞凋亡和表型耗竭的增加相关

为了评估HY+受体中CAR8细胞在CD19 +白血病进展的机制，研究人员在+7天和+14天分析了过继转移的CAR T细胞(CD45.2 +)上的表面CAR表达。当TCR抗原存在时，CAR8细胞中CAR的表面表达降低。类似地，TCR抗原的存在导致CAR4细胞中CAR表达降低，而CAR4细胞能够有效清除白血病细胞并防止早期复发，这表明CAR表达的丢失不能解释CAR8细胞在TCR抗原存在下效力低的问题。

接下来我研究人员测试了TCR抗原对CAR4和CAR8细胞扩增的影响。与HY-受体相比，在携带白血病的HY+受体中观察到增强的HY特异性CAR4扩增，而TCR抗原的存在导致了HY-特异性CAR8细胞的扩增减少(图3A)。

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此外，与HY-受体相比，HY-特异性CAR8细胞在HY+受体中含有显著高水平的裂解的caspase 3/7。(图3B)相反，随着TCR信号的加入，HY特异性CAR4细胞中裂解的caspase 3/7并没有改变，(图3C)。这些结果表明同时发生的CAR和TCR刺激通过增加凋亡限制了CAR8细胞的扩增。

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最后，研究人员评估了在TCR刺激存在的情况下，耗竭是否会导致CAR8细胞对白血病细胞清除的效果不佳。在白血病雌性小鼠中，CAR特异性CAR4和CAR8细胞在CAR刺激下与内源性T细胞(CD45.1 +)相比表达更高水平的PD-1和LAG3。雄性小鼠中TCR抗原的存在不会进一步增加HY特异性CAR4细胞上的PD-1或LAG3的表达水平。然而，TCR和CAR抗原的同时存在增加了相同小鼠中HY特异性CAR8细胞上PD-1和LAG3的表达。总的来说，这些结果表明定量和定性缺陷都会导致CAR8细胞在通过TCR同时刺激时根除白血病细胞的失败。

▪ CAR4细胞的持久性容易受到长期TCR刺激的抑制作用的影响

此外，研究人员还评估了在完全根除白血病细胞后，TCR抗原的长期存在对CAR4细胞持久性的影响。过继转移后80天，HY+受试者HY-specific CAR4细胞的百分比显著低于HY-受试者(图6A)。此外，在第80天，相比较于雌性小鼠(HY−)，雄性小鼠(HY+)持续的CAR4细胞含有增加的裂解的caspase 3/7和PD-1。这些结果表明，尽管CAR4 T细胞在一开始能够扩增，有效清除白血病细胞，但连续接触TCR抗原对CAR4细胞在体内的持久性存在负面影响，表明对白血病的长期监测可能会受到损害。

▪ TCR刺激对CAR8和CAR4细胞的不同作用与独特的CAR和TCR驱动的基因表达谱相关

研究结果表明，当通过内源性TCR刺激时，CD4和CD8T细胞之间存在显著的基因表达差异。尽管表达相同的CAR，但CD19刺激导致CAR4和CAR8细胞之间不同的基因表达模式(图7A)。与TCR刺激相比，CAR刺激下差异表达的基因更少。此外，通过内源性TCR和CAR刺激的CAR8细胞表达与仅通过内源性TCR刺激的CAR8细胞具有非常相似的图谱，表明在CAR8细胞中，TCR信号可以主导CAR信号。相反，通过两种受体刺激的CAR4细胞表达更类似于CAR刺激的图谱(图7A)。

正如研究人员所预测的，与经历相同刺激的CAR4细胞相比，CAR8细胞在通过TCR或CAR和TCR刺激后表现出促凋亡基因(Casp3、Bik、Bak1和Bok)的显著升高。除了凋亡基因之外，与CAR4细胞(包括PD-1和LAG3)相比，CAR8细胞的抑制受体基因的表达增加。总而言之，这些结果表明除了耗竭和细胞凋亡之外的其他途径可以用于改善CAR T细胞的扩增、持续性和有效性。

▪ 结语

临床试验已经证实，CAR-T细胞治疗可以非常有效地诱导CD19 +癌症患者的缓解。而在大多数患者中延长缓解的持久性将是CAR T细胞用于B细胞恶性肿瘤的临床开发中的重要的下一步。但初步经验表明，诱导缓解将会面临很多实质性的挑战。虽然改进靶点的选择可以克服这些挑战中的一些，但同样也需要优化CAR T细胞生物学的方法。

目前，研究人员普遍认为CAR T细胞的持续存在和免疫记忆的产生对于患者的长期缓解是至关重要的。今天的这项研究揭示了CAR T细胞生物学的重要方面，对于CAR和TCR同时参与的激活和持续性具有广泛的意义，消除了TCR以避免同种异体反应性的并发症，有开发“off-the-shelf”CAR T细胞产品的热情。另外值得注意的是，虽然研究数据表明这样的策略可能有利于增强CAR8细胞的扩增、有效性和早期的持续性，但TCR和CAR相互作用的生物学是复杂的，研究人员并不排除其他潜在的影响。

综上所述，由美国国家癌症研究所(NCI)领导的这项重磅研究为通过CAR设计和产品组成以提高CAR T细胞疗法的治疗潜力提供了指导意义。

参考出处：

DOI: 10.1126/scitranslmed.aag1209

http://stm.sciencemag.org/content/9/417/eaag1209

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