番茄分子育种现状与展望——从基因克隆到品种改良

作者单位：北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，中国科学院遗传与发育生物学研究所，植物基因组学国家重点实验室

摘 要：在界定分子育种概念的基础上，综述了近 30 年番茄主要农艺性状相关基因克隆及其调控的 研究进展，简要分析了番茄分子育种研究现状，初步探讨了未来中国番茄分子育种的发展策略。

番茄起源于南美洲安第斯山脉，在墨西哥完成驯化，于16世纪传到欧洲。除了栽培番茄，番茄属还包含12个野生番茄种。本文从分子育种的视角对近年来在番茄分子生物学、功能基因组学等领域的研究进展做一综述，并对番茄分子育种的发展方向进行分析和探讨。

1 分子育种的界定

在传统的植物遗传育种实践中，研究人员一般基于现有的种质资源，通过有性杂交和后代的表 型选择进行农艺性状的转移与改良，育种周期较长、遗传改良效率偏低。分子育种，是指在对控制农艺性状的关键基因或QTL功能认识的基础上，将现代生物技术手段整合于传统育种方法中，创新种质资源，提高选择效率，实现有目标的设计育种。分子育种可大幅度提高育种效率，缩短育种年限，在提高产量、改善品质、增强抗性等方面已显示出巨大潜力，成为现代作物育种的主要方向。 根据分子手段参与形式的不同，分子育种主要包括以下两方面的内容。

（1） 分子标记育种。分子标记育种（又称分子标记辅助选择） ，利用与目标基因紧密连锁的分子标记（或基于目标基因本身的功能标记）作为选择标记，在育种选 育过程中，通过分子标记的筛选来完成目标性状的选择。分子标记辅助育种实现了由表型选择到基 因型选择的过渡，无论在选择效率还是选择精度上都比传统选择育种有很强的优势。近年来，随着 高通量分子标记检测技术，基因组重测序和生物统计分析方法的飞速发展，可以同时对大量样本材料进行前景选择（目标性状）和背景选择（遗传背景），大大提高了选择的精度和效率。分子标记技 术除了应用于品种选育过程，在诸如基因聚合、回交转育、遗传多样性分析、杂种优势预测、种子 纯度和真实性检测、新品种保护等方面也显现出巨大的应用前景。

（2） 基因组编辑育种。传统杂交育种常受物种间生殖隔离限制和连锁累赘的影响。以转基因、 定向诱导基因组局部突变和基因组编辑等技术为代表的基因组编辑育种可以打破生殖隔离、连锁累赘等因素的限制，实 现目标性状的快速精准改良。转基因育种是利用重组DNA技术，将功能明确的基因或DNA片段通过遗传转化手段导入受体品种基因组，并使其表达目标性状的育种方法。由于克隆的基因可来自任何物种，所以转基因育种能打破基因在不同物种间交流的障碍。TILLING 则是利用高通量突变检测技术在人工诱变或自然群体中快速准确地鉴定出目标基因突变个体的技术方法。 基因组编辑技术是利用序列特异的核酸酶在基因组特定位点诱导产生DNA双链断裂，进而激活细胞自身修复机制，实现对基因组的精确修饰（替换、插入或缺失等）。规律成簇间隔短回文重复序列及其核酸酶系统（CRISPR/Cas9），由于编辑效率更高，操作更为简便，成本更低，可同时对多个靶点进行编辑等特点成为当前最为主流的基因组编辑技术。CRISPR/Cas9 和 TILLING技术在功能基因组学研究、优异种质资源创制、有利等位基因挖掘以及作物定向育种等方面具有巨大的应用潜力。

从技术层面讲，传统育种是分子育种的基础，而分子育种则是传统育种的补充与升级。分子育种技术体系的建立很大程度上依赖于对作物农艺性状形成的分子机制的认知。对控制重要农艺性状关键基因或 QTL 的定位、克隆和功能分析可以为分子标记育种提供实用标记，为基因组编辑育种提供靶标基因。在此基础上，利用QTL的遗传效应、QTL之间的互作、QTL与环境之间的互作等信息模拟和预测各种可能基因型组合的表现型，最终实现有目标的设计育种。

2 番茄主要农艺性状形成的分子机制

番茄是研究果实发育、合轴分枝、复叶形成和抗病性的经典模式植物，上述性状表现与其生长 发育和商品品质密切相关，因此也是研究驯化和遗传改良的主要对象。前人已对上述专门领域相关的研究成果做了详尽综述。本文简述近年来番茄主要农艺性状形成的分子机制研究进展，重点介绍利用正向遗传学手段克隆/定位的关键基因和 QTL（表 1，表 2）。

2.1 果实大小与形状

番茄果实质量是一个典型的数量性状，由多个基因共同控制。目前已知的控制番茄果实质量的 主效 QTL 大约有 10 个，其中 4 个已经被克隆。fw2.2 是番茄中第一个克隆的位于第 2 染色体上的控 制果实质量的 QTL，也是作物中克隆的第一个 QTL。该位点编码一个抑制细胞分裂的膜定位蛋白，可以解释野生番茄和普通大果番茄果实质量差异的 30%。与野生番茄相比，普通大果番茄中 fw2.2 的表达量更低，细胞分裂更活跃，胎座和中柱更大（Frary et al.，2000）。目前关于 fw2.2 调控细胞分裂活性的具体机制还不清楚。fw3.2是另外一个被克隆的位于番茄的第 3 号染色体上的果实质量 QTL，该位点编码一个 CYP78A 亚家族的 P450 蛋白 SlKLUH，通过增加果皮和中隔组织的细胞数而使果实变大。Chakrabarti 等（2013）发现该基因启动子中 1 个 SNP 与果实质量高度相关，这个 SNP 可 能导致 SlKLUH 表达调控元件的突变，进而使得 SlKLUH 的表达量上升和果实质量增加。与 fw2.2 和 fw3.2 不同，locule number（lc）和 fasciated（fas）主要通过增加番茄果实的心室数而使果实变大。 lc 对心室数的影响相对较小，只能把心室数由 2 个提升到 3 ~ 4 个。相比而言，fas 可将心室数提升 至 6 个，这两个遗传位点的上位互作可使番茄心室数达到 8 个以上，果实质量也增加一倍。Lc 位于番茄的第 2 号染色体上，Munos 等（2011）通过图位克隆方法在 WUSCHEL 基因下游鉴定到两个与心室数高度相关的 SNP 位点，暗示 lc 的表型可能与 WUSCHEL 有关。fas 突变是由 11 号染色体上 1 个 294 kb 染色体片段的反转所致，一直以来人们把 fas 多心室的表型归因于染色体片段反转位点附 近一个 YABBY 转录因子基因的失活（Cong et al.，2008），最近 Xu 等（2015）认为 fas 的表型更可能是由于反转位点附近另一个基因 CLAVATA3（CLV3）表达量降低造成的。此外，Xu 等（2015）还鉴定到另外两个控制番茄果实心室数的位点 Fasciated and branched（FAB）和 Fasciated inflorescence（FIN），FAB 编码 CLV3 的受体激酶 CLV1，而 FIN 编码一个可以对 CLV3 进行翻译后 修饰的阿拉伯糖基转移酶。

番茄的驯化改良除了使果实变得更大，也极大增加了果实形状的多样性。野生番茄果实一般为圆形，而现代栽培番茄的果实形状各异，可以分为圆形、椭圆形、扁圆形、矩形、长形、梨形、心形和牛心形等8个类型。目前已克隆或精细定位的5个控制果形的基因 LC、FAS、OVATE、SUN 和 FS8.1 可以解释大部分栽培番茄果形的变异。lc 和 fas 通过增加果实的心室数使果实变扁，而 OVATE、 SUN 和 FS8.1 主要控制果实的伸长。OVATE 编码一个果实伸长的负调控因子，该基因的突变导致番茄果实呈梨形（Liu et al.，2002）。值得注意的是，并非所有含 ovate 突变的遗传背景都呈梨形，说明 ovate 可以和基因组中其它位点互作导致梨形果实的形成。Sun 在促进果实伸长方面比 ovate 效应更强，Sun 位点突变是由于逆转录转座子 Rider 介导的一个 24.7 kb 片段的重复使得 IDQ12 基因表达上升所致（Xiao et al.，2008）。fs8.1 是另一个控制果实伸长的 QTL，该位点主要控制矩形番茄（常 见于加工番茄品种）的形成，Sun 等（2015）已将 FS8.1 定位到 8 号染色体一个 3.03 Mb 的区段内， 预计很快会被克隆。就驯化进程而言，Rodriguez 等（2011）通过分析 368 份番茄种质资源中 LC、 FAS、OVATE 和 SUN 突变等位基因的分布和频率，研究了番茄果形的驯化历史，发现 lc、ovate 和 fas 突变发生在番茄驯化的早期，而 Sun 突变很可能是在番茄传入欧洲以后才产生。相比而言，lc 突变的产生比 ovate 和 fas 更早。

2.2 果实成熟

近20年来，人们在番茄中鉴定、克隆了一系列果实成熟相关的基因，并对番茄果实成熟的遗 传调控机制进行了深入研究。番茄是典型的呼吸跃变型果实，其成熟严格依赖于乙烯的合成及信号传导。已有研究表明，果实成熟突变体 Never ripe（Nr）、Green ripe（Gr） 和 yellow fruited tomato 1（yft1）均是由于乙烯信号传导受阻而无法正常成熟。其中 NR 编码乙烯受体之一 LeETR3；GR 编码拟南芥 RTE1的同源蛋白，RTE1 蛋白被报道可与乙烯受体 AtETR1 互作并修饰 AtETR1 的活性；YFT1则编码乙烯信号途径重要调控因子EIN2。其它一些参与乙烯合成和信号传导的基因，如 ACS2、 ACS4、ACO、EIL1 等，也在番茄果实成熟过程中发挥重要作用。另外3个番茄突变体 ripening inhibitor（rin）、non-ripening（nor）和 Colorless non-ripening（Cnr）在果实成熟方面具有类似的特点：（1）果实不能正常成熟；（2）无法合成果实成熟必需的乙烯；（3）外源施加乙烯也不能成熟，说明这3个基因可能作用于乙烯的上游，通过依赖和不依赖乙烯的信号途径调控果实成熟。图位克隆分析显示 RIN 编码一个 MADS-box 转录因子，Nor 编码一个 NAC 转录 因子，而 Cnr 则是一个表观遗传突变，该突变是由于一个 SBP 类型的转录因子基因启动子区域DNA甲基化升高导致的。上述 3 个突变体除了不能合成乙烯，在果实软化、类胡萝卜素积累、风味物质合成等方面也受到明显的抑制。染色质免疫共沉淀试验显示 RIN 可以直接调控一系列成熟相关基因的表达，包括乙烯合成相关基因（ACS2、ACS4 和 ACO1），细胞壁代谢相关基因（PG2a 和 EXP1），类胡萝卜素合成基因（PSY1 和 PDS），风味物质合成相关基因（TomLoxC、ADH2 和 HPL）以及一些果实成熟相关的转录因子基因等。值得注意的是，rin 和 nor 突变体被育种家广泛用于延长番茄货架期和提高果实硬度，rin 主要用于大果番茄，而 nor 主要应用于樱桃番茄。 在番茄中还鉴定到另外一些调控果实成熟的转录因子，如 TOMATO AGAMOUS-LIKE1 （TAGL1）、FRUITFULL（FUL1 和 FUL2）、HD-Zip homeobox protein（LeHB-1）和 APETALA2a （AP2a）。

近年来番茄果实成熟的调控网络已基本掌握，但仍有一些关键问题尚待探究，例如激 活果实成熟过程的发育信号到底是什么，果实成熟过程中乙烯的大量合成是如何被开启的，乙烯的 大量合成是果实成熟的原因还是结果。

2.3 颜色形成

目前番茄中已克隆多个果肉颜色发生变化的突变体，其中6个是由于类胡萝卜素合成途径的酶突变引起的。yellow flesh 为黄色果肉，由八氢番茄红素合成酶基因 PSY1 突变导致；tangerine 和 fruit carotenoid-deficient 为橘黄色果肉，分别由类胡萝卜素异构酶基因 CRTISO 和异戊烯基焦磷酸异构酶基因 IDI1 突变导致。两个来源于野生番茄的显性突变位点 Beta 和 Delta 也可使果肉呈橘黄色，其中 Beta 编码番茄红素β–环化酶，而Delta编码番茄红素 ε–环化酶；old gold与Beta互为等位基因，old gold功能缺失突变体 因无法合成 β–胡萝卜素而使果肉呈深红色。番茄白色果实突变体 lutescent 2 是由于叶绿素缺陷导致的，最近 Barry 等（2012）证明 Lutescent 2 编码一个叶 绿体定位的锌离子金属蛋白酶。番茄绿果肉突变体 green flesh 是由于STAY GREEN（SGR）基因突变导致的，其果实在成熟过程中叶绿素降解不完全，与番茄红素同时存在，使得果实颜色呈现锈红色 到棕色甚至紫/黑色。

质体（包括叶绿体和有色体）是合成叶绿素和类胡萝卜素的主要场所，果实中质体大小和数量 的变化也影响番茄果实的颜色。番茄高色素突变体 high pigment 1（hp1）、high pigment 2（hp2）和 high pigment 3（hp3）中类胡萝卜素含量的增加都归功于质体数的增多和体积增大。HP1 和 HP2 分别编码光信号负调控因子（UV-damaged DNA-binding protein 1，DDB1）和 DE-ETIOLATED1（DET1）， 而 HP3 编码玉米黄质环氧化酶（Zeaxanthin epoxidase，ZEP）。番茄果实中叶绿体的发育和叶绿素的分布主要受 Uniform ripening（U）位点 的控制。U 编码一个 MYB 转录因子 Golden 2-like 2（GLK2），GLK2 在果实中的梯度表达使番茄果肩呈深绿色。GLK2 的功能缺失（u）使果实整体颜色呈均匀淡绿色（无深绿色果肩），叶绿体发育 受损，成熟果实中色素和糖的积累降低。长期以来，在人们追求番茄果实均匀 着色的育种实践中，U 位点受到了强烈的选择，现代栽培番茄中很多品种因不含有功能性 GLK2而无法形成绿色果肩。尽管这种选择使得番茄果实着色更加均匀，但选择的代价就是番茄的品质受到 很大影响。与 u 类似，另一个番茄果色突变体 uniform gray-green（ug）的未成熟果实也无绿肩。近期的研究表明UG编码一个KNOX转录因子TKN4，TKN4作用于 GLK2 的上游调控番茄果实中叶 绿素的梯度分布。

普通红果番茄的果皮为黄色，主要是由于柚皮素查耳酮等物质的积累所致。在粉果番茄中，果 皮因无法积累柚皮素查耳酮等物质而使得果实整体颜色呈现为粉色。Yellow 决定着果皮中柚皮素查耳酮等物质的积累与否，尽管前期研究表明 Yellow 编码一个 MYB 转录因子 SlMYB12，但导致该基因在粉果中失活的变异位点一直不清楚。最近，中国科学家通过全基因组关联分析发现 SlMYB12 启动子区域一个 603 bp 缺失导致该基因表达下降是粉果形成的主要原因。大多数栽培番茄果皮中并不积累花青素，但野生番茄 Aubergine （Abg）、Anthocyanin fruit（Aft）和 atroviolaceum（atv）等位点的渗入重新赋予栽培番茄合成花青 素的能力，使其果皮中积累花青素，形成紫色番茄。目前 ABG、AFT 和 ATV 还未被克隆，有证据显示 AFT 可能编码花青素合成途径中的调控因子 SlANT1 或 SlAN2。

2.4 风味品质及单性结实

现代栽培番茄的风味品质下降主要是由于野生抗病位点渗入导致的连锁累赘，货架期延长带来的负面效应以及 uniform ripening 的应用等。番茄果实的风味品质是复杂的数量性状，受到糖、酸， 糖酸比，挥发性化合物以及果实质地等因素的影响。Brix9-2-5 是一个重要的控制番茄果实可溶性固形物含量的QTL位点，该位点最初在潘那利番茄 LA0716 和番茄栽培种 M82 组配的渐渗系群体中被发现。Brix9-2-5能使葡萄糖含量提高 28%，使果糖含量提高 18%，其编码一个质外体蔗糖转化酶 Lin5，主要负责将蔗糖水解为果糖和葡萄糖。普通栽培番茄果实主要含果糖和葡萄糖，基本不含蔗糖；而绿果野生种番茄果实含有蔗糖。Chetelat 等（1995）从野生番茄克梅留斯基（S. chmielewskii）LA1028 中鉴定到一个调节成熟果实中蔗糖含量的主效QTL位点 Sucr （Sucrose accumulator）。SUCR 编码一个液泡型蔗糖转化酶，Sucr 位点可以提高成熟果实中的蔗糖、 总糖和可溶性固形物含量。此外，人们在多毛番茄 LA1777 中发现了一个可以增加未成熟果实淀粉含量和成熟果实可溶性固形物含量的基因 AGPL1（H），AGPL1 编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的大亚基。目前克隆的与番茄风味品质相关的基因还包括控制果实挥发性物质合成的 AADC、LoxC 和 CXE1（Klee & Tieman，2013）以及控制果实质地的 EXP1、PG2a 和 PL 等。

单性结实育种是现代番茄育种密切关注点之一。目前已报道的控制番茄单性结实的基因位点有8个：pat、pat2、pat3/pat4、pat4.1/pat5.1 和 pat4.2/pat9.1。比较有利用价值的两个资源材料为 ‘Severianin’（pat2）和‘RP75/79’（pat3/pat4），主控基因均为隐性。目前这些单性结实基因均未被克隆。生长素和赤霉素在调控番茄单性结实方面发挥重要作用。生产上人们通常利用生长素类似物 2,4-D 蘸花提高番茄的坐果率（人工单性结实），而 pat、pat2、pat3/pat4 单性结实的性状均是由于子房内赤霉素含量增加所致。研究表明，生长素和 赤霉素信号途径中的一些基因的突变或沉默也可诱发番茄的单性结实，如 ARF7、ARF8、IAA9 和 DELLA 等。