小麦抗旱基因工程研究进展

单位：河北农业大学农学 河北农业大学动物科技学院 河北农业大学生命科学院 中国科学院大 学生命科学学院

摘要：小麦是人类重要的粮食作物，干旱是影响小麦产量、质量和种植范围的非生物胁迫因子，近年来小麦抗旱基因工程发展迅速。本研究总结了国内外小麦抗旱基因工程最新的研究成果。从与抗旱相关的转录因子类基因、LEA 蛋白基因、信号转导相关基因、代谢调节相关基因、氧化调控相关基因 5 个方面对小麦 抗旱相关基因的克隆情况进行了总结并从转化受体和转化方法、抗旱基因导入小麦的研究现状两个方面对转基因小麦进行了总结，并对提高小麦抗旱基因工程的研究效率提出了建议。


目前，水资源短缺是全球关注的生态环境问题， 干旱和半干旱地区占全球土地总面积的 36%，占耕地总面积的 43%，在我国，干旱半干旱地区占国土总面积的 45%，占耕地总面积的 51%。干旱首先造成植物生理性脱水，进而降低光合作用，导致呼吸作用增强，造成膜伤害，引起代谢失调，最终抑制植物生长。在众多非生物胁迫因子中，干旱对植 物造成的影响居首位。小麦是世界总产量排名第二的粮食作物，也是我国第二大粮食作物，是人类的主要粮食之一。干旱严重影响了小麦的产量、质量以及种 植范围，加剧了全球性的粮食危机。因此，开展抗旱育 种工作十分必要。植物的抗旱性是多基因控制的数量性状，如果利用传统的育种方法，存在周期长，种质资源有限，容易受到外界环境的影响这些局限性。基因工程育种可以克服传统育种的以上缺 点，周期短，并且可以打破种属的界限，使有限的遗传资源趋于无限化。与水稻、玉米等其他重要农作物相比，小麦因为基因组庞大、再生能力差等诸多问题，造成小麦基因育种起步较晚且速度缓慢，但经过许多学者的努力，也取得了一定的进展。本研究介绍了国内外小麦抗旱基因工程最新研究进展，为提高该领域研究 效率提出了建议。

1 小麦抗旱相关基因克隆研究概况

在干旱胁迫下，小麦能够感知和传递胁迫信号， 启动相关基因的表达，目前已经有许多抗旱相关基因 被克隆出来。

1.1 抗旱相关转录因子类基因克隆

bZIP 类转录因子是植物碱性亮氨酸拉链蛋白，是植物体内非常重要的一类转录因子，高世庆（2007）从小麦中克隆到一个新的 bZIP 转录因子基因 TaAREB 并将其转入拟南芥和烟草中进行抗逆功能鉴定，结果表明，该基因增强了拟南芥和烟草的抗旱性。丁长欢等(2012)克隆了 1 个小麦 WRKY 型转录因子基因 (TaWRKY46)，开放阅读框为 669 bp，编码 222 个氨基 酸残基，对其幼苗利用 10% PEG6000 模拟干旱处理， 收集不同时段根系进行鉴定，发现该基因的表达在 3 h 的短期处理内就会明显增强，以后至 23 h 时间内其表达水平维持相对稳定，表明该基因参与干旱胁迫的响 应。2013 年，Wang 等(2013)也在小麦中克隆了一种该类型的基因 TaWRKY10，并将其导入烟草中获得转基 因植株，逆境胁迫下的功能鉴定结果表明，转基因植株与对照相比具有较高的种子发芽率、存活率、相对含水量、脯氨酸含量和可溶性糖含量，并且具有较低的活性氧和丙二醛含量，表明该基因过表达可提高转基因植株的耐盐抗旱性。NAC 是植物中特有的转录因子家族，曾有研究表明，过表达 SNAC1/2 可提高水稻的干旱耐受性(Hu et al., 2006; 2008)；宋鹏等(2012)成功克隆了小麦的 TaSNAC1 基因，并使用 20% PEG6000模拟干旱处理，Real-Time PCR 结果表明，在干旱胁迫 下，TaSNAC1 基因表达上调。Huang 等(2015)在小麦中也克隆了一个该转录因子家族的基因 TaNAC29，并将该基因导入拟南芥进行功能分析，结果发现，干旱和盐分胁迫下转基因植株具有较低的丙二醛和过氧化氢水平和较高的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量， 表明转基因植株的耐盐抗旱能力得到提高。MYB 类转录因子是植物中最大的一类转录因子，TaMYB1 是 在小麦中克隆的一个该类型的转录因子基因，属于 R2R3-MYB 类，该基因的表达受根中氧浓度的调控， 同时又受盐、干旱和 ABA 的诱导(Lee et al., 2007)；张立超(2013)在小麦中克隆了一个抗旱相关的R2R3-MYB 类型的转录因子 TaMYB30，并将其导入拟南芥，抗逆性鉴定表明：该基因提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性；关于 MYB 基因另有很多其他报道(Caietal., 2011; Qinetal., 2012)。陈芳(2015)在小麦根系中克隆得到转录因子 TaNF-YB2;1，对其在小麦根系中的表达特征进行研究发现，该基因在干旱胁迫下表达量明显上升， 将其转化入烟草中获得的转基因烟草，在干旱条件下生长得到明显改善，表明转化 TaNF-YB2;1 植株可以提高抗旱能力。

在抗旱相关转录因子的基因克隆方面，DREB 类转录因子研究较多。DREB 家族分为两类：一是受冷胁迫表达上调的 DREB1；二是对干旱或高盐响应的 DREB2 (Liu et al., 1998)。于月华等(2014)利用 RT-PCR 技术从小麦中克隆了 DREB 基因，并以 pMD18-T-DREB 质粒为模板，PCR 扩增 DREB 基因片段，构建了该基因的植物表达载体。郑甲成(2010) 也在小麦中克隆到了 DREB 基因，并转化到拟南芥中进行抗性分析，结果表明，DREB 基因过表达可提高转基因拟南芥的抗旱性。

1.2 LEA 蛋白基因克隆

LEA 蛋白共有 6 组，Ried 等(1993)的研究表明， 在严重干旱的小麦幼苗中，第 3 组 LEA 蛋白的累积量与组织的耐旱能力密切相关。闵东红等(2012)从普通小麦中成功筛选出 LEA 蛋白基因 TaLEAL3，实时荧光定量 PCR 分析表明，在干旱胁迫下，TaLEAL3 基因表达上调。龙翔宇等(2014)在小麦中克隆出了 TaLEA2 基因，属于第 2 组 LEA 蛋白，150 mmol/L PEG 干旱诱导结果显示，在干旱胁迫下，该基因的表达上调。这些 试验表明编码 LEA 蛋白的基因受到干旱胁迫的诱导。

1.3 信号转导相关基因克隆

张洪映(2011)在小麦中克隆了一个蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族 2 (sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2, SnRK2)基因 SnRK2.8，研究结果表明该基因参与了植物体内糖代谢及抗逆信号传递途径， 其过表达后可以显著增强植物的抗旱、抗盐等一系列抗逆性状，关于该基因，Zhang 等(2013)在别的文章中也有论述。Tian 等(2013)在小麦中克隆了该家族的另 一个基因 TaSnRK2.3，并将其导入拟南芥中进行功能鉴定，结果表明，逆境胁迫下，该基因过表达可使转基因植株降低失水率，增强细胞膜稳定性，提高光合潜 力，增加脯氨酸含量，转基因植株的抗逆性得到改良。钙离子是细胞内重要的第二信使，广泛参与细胞内的信号传递，当植物遭到非生物胁迫时，钙离子可发挥重要作用(Luan et al., 2002)，龙翔宇等(2013)克隆了一 个钙调磷酸酶 B 类似蛋白(calcineurin B-like proteins, CBL)基因 TaCBL7，150 mmol/L PEG 干旱诱导结果表明，干旱胁迫下，该基因的表达量增加。肖瑞霞等(2015) 克隆了一个与钙离子结合 C2 结构域蛋白 TaC2DP1， 20% PEG 处理结果显示，干旱诱导下，该基因表达量 稳定上调。还有人做过钙网蛋白对干旱胁迫的响应 (Jia et al., 2008)。14-3-3 蛋白是一种信号调节因子，调控许多胁迫响应，在其他作物上也做过该蛋白对逆境 胁迫的研究(Chen et al., 2006)。任江萍等(2012)从小麦中克隆到一个 14-3-3 蛋白基因 Ta14S，PEG 处理表明，干旱诱导会使该基因表达量增加。Christov 等 (2014)从小麦中克隆到了一个类 GSK3/shaggy 激酶基 因 TaSK5，并将该基因导入拟南芥进行功能鉴定，结果表明，转基因拟南芥中该基因过表达可以提高转基因 植株的耐盐性和抗旱性。

1.4 代谢调节相关基因克隆

植物受干旱胁迫时会改变基本的代谢，特征之一 是蛋白酶的变化。在干旱胁迫下，各种形式的半胧氨酸蛋白酶被激活，以降解干旱胁迫下失活的蛋白质。 臧庆伟(2005)从小麦中克隆了半胱氨酸蛋白酶基因 TaCP，并将其转化到拟南芥中进行功能分析，结果表明，转基因拟南芥的抗旱性增强。

1.5 渗透调节相关基因克隆

庞建周(2011)以抗旱小麦为材料，克隆到一个蔗糖转运蛋白(sucrose transporter, SUT)基因，命名为TaSUT1，半定量 RT-PCR 和实时定量 PCR 结果表明，干旱胁迫提高了该基因的表达。另外，Abebe 等(2003)从小麦中克隆了与抗旱和耐盐相关的 l- 磷酸甘 露糖醇脱氢酶基因 mtlD。

1.6 氧化调控相关基因克隆

谷胱甘肽过氧化物酶( glutathione peroxidase, GPXS)是植物体内清除活性氧的主要酶，与植物抗逆性紧密相关，张蕾等(2015)从小麦中克隆出 GPX 基因，并将其转入农杆菌中，便于遗传转化。超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，清除自由基的首要物质，有试验克隆了小麦的超氧化物岐化酶(SOD)基因，并证明在干旱胁迫下，SOD 活性上升(Zhang et al., 2008)。

2小麦转基因研究概况

1983 年第一株转基因植物诞生，1992 年，Vasil 等(1992)利用基因枪法将 GUS/Bar 基因导入小麦，获得转基因植株，标志着世界上第一株转基因小麦的问世，转基因小麦的研究由此开始迅速发展。在我国， 1997 年，Cheng 等(1997)成功获得可育的转基因小麦植株；1999 年，Xia 等(1999)首次报道获得了稳定胚性组织的转基因小麦植株。

2.1 转化受体及转化方法

最初，小麦再生是利用悬浮细胞和原生质体(Vega et al., 2008)。如今，小麦遗传转化所用的外植体非常广泛，还包括包括幼胚、成熟胚、花药愈伤组织、幼穗、叶 片、顶端分生组织、根、雌蕊、盾片组织等(Sahrawat et al., 2003; 武丽敏等, 2003; Shewry and Jones, 2005; Bhalla, 2006; 李根英等, 2007)。小麦转基因方法大体可以分为不依赖于组织培养的转化法和依赖组织培养的转化法两类，前者如花粉管通道法和显微注法；后者包括农杆菌介导法、基因枪法、电穿孔法和 PEG 法等。目前，获得转基因小麦的方法主要集中在基因枪 法(68.8%)和农杆菌介导法(15.9%) (喻修道等, 2010)。
转基因方法的成败与基因转化受体的可操作性密切相关，根据采用的转基因方法的不同需要使用不同的基因转化受体(葛维德和钮旭光, 2007, 辽宁农业科学, 2: 40-43) (表 1)。