蛋白质组学方法评估转基因抗虫玉米非预期效应

植物转基因技术的目标是将有利于植物自身或满足人类需求的特定外源基因整合进入受体植物基因组中，使其获得外源基因所表现的特定性状并能够稳定遗传。这些性状就是转基因植物的目标性状，也称为预期效应。

由于外源基因整合位点不确定，加之外源基因产物本身也可能使受体植物的能量代谢和物质代谢发生变化，从而影响其固有的生理代谢过程，乃至改变受体植物的固有性状。这些性状改变均是转基因育种设计过程中无法控制和预期的，这 些无法控制和预期的性状改变均称为非预期效应。

不同转Bt基因的抗虫玉米材料不但在目标基因上明显不同，而且由于受体材料差异和回交转育过程的不同，造成了最终的抗虫转基因玉米材料间存在着巨大的差异。这些遗传背景上的差异是否会产生非预期效应仍研究甚少，目 前的研究还主要集中在Bt基因的抗虫目标预期效应 上。转基因抗虫玉米 SK12-5、IE034、Bt799z 和 Bt799zd 是中国自主研发的具有潜在产业化前景的转基因新材料，围绕上述新材料已开展了大量育种研发 工作及所获相应育种材料的环境安全和食用安全评价研究，但是，对这些材料的非预期效应研究未见 报道。

利用双向电泳技术对上 述转基因抗虫玉米的 4 种不同遗传背景材料的转基因材料进行了比较分析，一方面在蛋白质组水平比较不同转基因材料的差异；另一方面从组学的水平初步评估了实验材料蛋白水平上是否发生了影响转基因材料安全性的非预期效应，为非预期效应评价提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料：编号1#为具有转cry1Ab/cry2Aj并有ZD958遗传背景的杂交种SK12-5zd，由浙江大学提供。编号2#为转 cry1Ie 并有Z58遗传背景的自交系IE034z，由中国农业科学院提供。编号3#为转mcry1Ac并有Z58遗传背景的自交系Bt799z，编号4#为转mcry1Ac并有ZD958遗传背景的杂交种Bt799zd，均由中国农业大学提供。选取非转基因的自交系 Z58 和杂交种ZD958作为对照材料，编号分别为5#和6#。编号2#和3#的转基因自交系是目标遗传转化体经2代自交后，再与Z58材料进行6代回交转育后获得了具有纯合、稳定遗传背景的转基因自交系。 上述转基因材料均已采用国家发布的转基因检测标准进行了外源基因分子特征鉴定，证明均为独立转化事件，并已进入环境释放以上的转基因安全评价试验阶段。

2014年6月，将试验材料种植在吉林省公主岭市 的吉林省农业科学院的人工温室中，幼苗长至5叶1心期进行取样，每种试验材料取长势基本一致的 6个单株的最上部完全展开叶片，混合作为一个样本。液氮冷冻后，迅速放入干冰中运输至实验室，-80℃保存。

1.2 玉米叶片总蛋白提取

将叶片去主脉后剪成1cm的小段，称取0.5 g叶片加入50 mg PVPP 进行充分研磨；加入7.5 mL经 -20℃预冷的蛋白提取缓冲液Ⅰ，冰浴研磨 5 min，转入预冷的 10 mL 离心管中，-20℃放置1 h；4℃，13 000 r/min 离心45 min，弃上清；加入7.5 mL经-20℃预冷的蛋白质提取液Ⅱ，悬浮振荡，-20℃放置 1 h；4℃， 13 000 r/min 离心 45 min，弃上清，重复 2 次；加入 7.5 mL 80%预冷的丙酮，充分悬浮后，离心去上清； 沉淀真空干燥并称重。每种材料各重复 3 次，获得的蛋白用 Bradford 法[26]测定浓度后准备进行蛋白质双向电泳分析。

1.3 蛋白质等点聚焦

采用长度 24 cm，pH 3—10 的线性干胶条（Biorad， 美国），取蛋白提取液与水化缓冲液（8 mol•L-1 Urea、 2 mol•L-1硫脲、4% CHAPS、0.002%溴酚蓝，用前加入 65 mmol•L-1 DTT 和 0.2% IPG Buffer）混合至总体积 450 μL（含蛋白质约为 1 200 μg），采用被动水化 的方法处理 18 h。将水化后的胶条转移到等电聚焦槽 上（胶条酸性端置聚焦盘的“+”端，碱性端置聚焦 盘“-”端）。每根胶条加入 3 mL 矿物油，将润湿的滤纸 1/3 处放在胶条的两端夹上电极夹，扣紧聚焦盘， 等点聚焦程序和参数设置参照 Biorad 产品说明书。等点聚焦结束后，将胶条置于平衡缓冲液（6 mol•L-1 Urea、75 mmol•L-1 Tris-HCl（pH 8.8）、2% SDS、25% 甘油、0.002%溴酚蓝）振荡平衡 2 次，每次 15 min。 第一次平衡在缓冲液中加入 1% DDT；第二次平衡在 缓冲液加入 2.5%碘乙酰胺（IAM）。平衡完毕后取出 胶条轻轻用平衡缓冲液润洗，然后去除多余的平衡缓冲液，准备 SDS-PAGE 电泳。

1.4 SDS-PAGE

将平衡好的胶条置于第二向凝胶上方，排除气泡使二者紧密接触，用 1%琼脂糖凝胶封固胶条，接通电源。第一阶段 1 W/gel 运行 1 h；第二阶段 13 W/gel 运行直至溴酚蓝到达凝胶底端。双向电泳结束后， SDS-PAGE 凝胶置于固定液（10%冰醋酸、40%甲醇、 50%超纯水）中固定 3 h；凝胶固定后，超纯水冲洗 3 次，每次 15 min；加入考马斯亮蓝染色液染色（0.12%G-250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%甲醇）振荡过夜； 超纯水脱色至背景满意为止。

1.5 质谱鉴定与数据库分析

Image Scanner 扫描仪扫描脱色后的凝胶，用 Biorad PDQuest 8.0 软件分析不同玉米叶片材料的凝胶图谱，采用 YANG 等的方法，使用蛋白相对表达 体积（% Vol）来表述每一个匹配蛋白质点的表达丰度。差异蛋白质的表达丰度分析分别以 Z58 和 ZD958 材料的凝胶作为参考胶，只有蛋白质点在至少 2 个重复内被发现才被认为是真实的蛋白质点。定义平均相对表达丰度上调（出现）或下调（消失）差异大于2倍（ratio＞2），并且在统计学 T 检验上 P＜0.05的蛋白质为差异蛋白质点。差异蛋白质点使用液质联用质谱仪 LC-Q-TOF-MS 6520（Agilent Technologies，USA） 进行分析。使用 NCBI 玉米数据库（NCBI，Taxonomy： Zea mays，Entry：212235，2015/01/20）对蛋白质进行检索。蛋白检索结果的显著性判别标准：一般认为 PMF（Peptide Mass Fingerprinting，肽指纹图谱）在MS/MS 检索中离子分数≥88 分说明该蛋白的鉴定结 果有效，其他一些辅助标准包括至少 10%的序列覆盖率以及需要有 3 个肽段的匹配。

1.6 GO 和 KEGG 分析

采用 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）方法对质谱鉴定出的特异性蛋白（E value≤10−5 ）与 NCBI non-redundant（Nr）蛋白质数据库进行比较，确定相应的蛋白质并获得对应的基因信息，用DAVID方法对这些表达有差异的基因进行基因功能注释（gene ontology，GO）分析，对差异蛋白功能及代谢途径进行 KEGG 通路分析。

2 结果

2.1 差异表达蛋白的分离及鉴定

为了比较不同转基因抗虫玉米蛋白质组差异，对供试材料的叶片总蛋白进行了双向电泳分析。结果显示，各受试材料均可检测到超过1200个清晰蛋白点 。

将电泳胶图扫描后使用 Biorad PDQuest8.0 软件对每个转基因材料及其对照（1#和 6#、4#和 6#、2# 和 5#、3#和 5#）进行比较，对电泳凝胶上相对表达体积超过 2 倍的差异蛋白质点进行质谱仪分析，成功鉴定玉米基因组蛋白 61 个（表 1）。进一步分析特异蛋白点（只在转基因与对照的一个材料中出现） 和差异蛋白点发现，这些蛋白点中核酮糖二磷酸羧化酶相关蛋白点 15 个，ATP合酶类蛋白点 4 个，放氧 增强蛋白点 13 个，丙酮酸磷酸双激酶相关蛋白点 3 个，GADPH 酶相关蛋白点 2 个，类萌发素蛋白相关蛋白点 4 个，草铵膦乙酰转移酶相关蛋白点 2 个（3#和 4#），其他蛋白点6个，未知功能蛋白点 10 个。 这些蛋白所涉及的生化反应过程主要集中在光合作用、碳固定和能量代谢等方面。根据不同蛋白的功能以及质谱检测结果，对各类蛋白在不同转基因材料中变化的趋势进行了汇总分析（表 2）。结果显示，在4种转基因玉米材料中发现被认为参与植物对逆境胁迫响应的类萌发素类蛋白均有显著的表达升高；而只有质体蓝素钠一类蛋白在 4#材料中发生了表达显著降低；涉及光合作用及碳固定的相关酶类，如核酮糖二 磷酸羧化酶、ATP 合成酶、丙酮酸磷酸双激酶等均发 生了表达显著上调。在同为 ZD958 背景的 1#和 4#材料中，包括类萌发素蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶、PS Ⅱ的放氧增强蛋白的表达均发生了显著的升高；而在 同为 Z58 背景的 2#和 3#材料中，包括ATP合成酶、 放氧增强蛋白、类萌发素蛋白、肽基脯氨酰顺反式异构酶等蛋白的表达发生了显著升高。可以看出遗传背景相同的转基因玉米材料（1#和 4#、2#和 3#）在转入不同抗虫Bt基因后，其所引起的蛋白水平上的变化也 存在着一定的一致性。而不同遗传背景的转基因材料 （3#和 4#）转入相同抗虫 Bt 基因后，其蛋白水平上的表达变化则差异较大。