科学家实现自由行为斑马鱼全脑功能光学成像

近日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心王凯研究组（神经科学研究所）与温泉研究组（中国科学技术大学微尺度国家实验室）合作完成的论文《自由行为下幼年斑马鱼快速全脑神经活动成像》发表在eLife上。该研究发展了一种新型三维在体成像技术——扩增视场光场显微技术（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM），可以对斑马鱼幼体的全脑神经元进行高速神经活动功能成像。研究团队将该成像技术与一套快速三维追踪系统结合，实现了对自由行为下的幼年斑马鱼进行快速全脑神经元活动记录，并首次捕捉到斑马鱼幼鱼在捕食行为下高时空分辨率的全脑神经活动。研究打破了了长久以来神经科学领域只能对头部固定的活体斑马鱼进行全脑功能神经活动研究的局限，为研究斑马鱼幼鱼的感知运动神经环路提供了强有力的工具。

系统神经科学的中心目标之一，就是理解动物的神经环路活动与行为之间的联系。近年涌现的一批光学手段（如钙信号荧光成像、光遗传学等）已在神经科学领域取得了成功。在此过程中，斑马鱼幼鱼因其体积小、光学透明、行为丰富等特征成为理想的模式动物。光片显微技术（light-sheet microscopy）、双光子显微技术（two-photon microscopy）已在揭示斑马鱼行为神经环路机制上显示出潜力。

现有的斑马鱼全脑神经活动的记录都是在头部固定的活体斑马鱼上完成的。近年发展的虚拟现实技术（virtual reality）可以通过监测斑马鱼运动神经信号，并在斑马鱼周围实时反馈相应的虚拟图像来模拟自由运动的场景，但这种技术无法模拟一些较复杂的行为，例如捕食行为。更重要的是，在虚拟现实中，斑马鱼的本体反馈被忽略，本体反馈在感知运动行为中扮演着重要角色。因此，发展一套适用于自由行为下的斑马鱼幼鱼全脑神经活动记录的系统，成为斑马鱼研究领域的迫切任务。

此前，自由行为下的全脑成像技术已在其他小型动物上实现。由于斑马鱼幼鱼运动时的加速度和速度极快，准确快速地对其脑部实现三维实时追踪，无论是对系统硬件还是算法上都提出了很高的要求。此外，斑马鱼全脑的体积相对较大，如何在斑马鱼运动情况下实现对全脑的快速成像也是新挑战。研究团队从两方面入手：科研人员开发了一套高速三维追踪系统，解决了对快速运动的斑马鱼头部实时追踪的问题。在追踪系统中，他们分别利用高速相机和一组特殊设计微透镜实时监测斑马鱼头部的水平和竖直位置，并将此位置反馈给高速位移台和压电陶瓷做水平与竖直方向的位置校正。针对成像方法，研究人员创造性地发展出了新型体成像技术——扩增视场光场显微技术（XLFM）。该技术利用一组放置在成像系统傅立叶平面上的微透镜阵列，可以同时将物体不同方向的投影成像到相机上，相机采集到的图像经过特殊算法重构物体的三维信息。该成像方法不仅成像速度极快，以77Hz的速度记录斑马鱼幼鱼的全脑活动，且相较之前的体成像技术，空间分辨率得到了大幅提高，达到了3.4μm×3.4μm×5μm，在斑马鱼全脑中已接近单细胞分辨率。至此，该工作解决了斑马鱼幼鱼的追踪与成像两大问题。

研究人员将XLFM与高速三维追踪系统结合，捕捉到了斑马鱼幼鱼捕食行为下的全脑活动。斑马鱼的捕食行为涉及动机、感知、决策、运动控制、反馈等一系列复杂的神经环路功能，受到神经科学领域的重点关注。长久以来，人们受限于研究工具无法深入研究捕食行为背后的神经环路机制。该工作的完成填补了这一缺陷，这将极大地促进对斑马鱼幼鱼捕食等复杂行为神经机理的研究，对人们更好地理解感知运动相关的神经环路工作机理具有重要意义。该技术进一步拓展后亦可大规模监测其他小型动物神经系统的活动。

图1. XLFM斑马鱼幼鱼全脑成像。（a）XLFM示意图。微透镜阵列与物镜的后光瞳平面共轭。激发光为470 nm的蓝色激光。（b-c）不同竖直位置的点在相机上形成不同形状的图像，这些二维图像编码了物体的三维信息。（d）全脑细胞核标记GCaMP6f（huc：h2b-gcamp6f）的斑马鱼幼鱼的全脑最大强度投影（MIP）。（e）在t=0时刻光刺激后斑马鱼幼鱼不同神经元的荧光活动图，根据神经元的响应时间先后顺序进行排序。（f）（e）中的选定的神经元根据其响应的起始时间被标记了不同的颜色。刻度为100微米。

图2. 捕食行为中的斑马鱼幼鱼全脑成像。（a）在捕食行为中的6个关键时间点的全脑活动（上图）和对应的低被行为（下图）。用于定量分析行为的一些参数包括：斑马鱼-草履虫夹角a、两眼会聚角b、头部朝向g、斑马鱼-草履虫距离d。（b）全神经系统胞质GCaMP6s表达的斑马鱼全脑最大强度投影（MIP），四个感兴趣的脑区的边界已经被标出。（c）根据荧光信号亮度得到的四个脑区在捕食过程中的神经活动（上），以及对应的行为参数的变化（中、下）。