专访复旦大学王永明教授：基因编辑技术的发展与应用

自第三代基因编辑技术CRISPR技术的问世以来，它就接受了无数人的改造和验证，事实证明它是一个非常强有力而且仍有相当大潜力的工具，它的发现让基因治疗的研究上了一个新台阶。生物谷有幸邀请到复旦大学生命科学院、“国家青年千人”王永明教授为我们介绍基因编辑技术的目前发展情况和未来应用前景。

王永明教授从2010-2013年在斯坦福大学医学院从事博士后研究，于2013年9月回国组建实验室，所以较早地开展了技术改进的研究。CRISPR/Cas9技术主要面临两个核心问题，一个是如何避免脱靶，另外一个是如何提高编辑效率。在此之前，他曾试图利用ZFN技术和TALEN技术的优势对CRSPR的特异性进行改造，但是由于学生刚进实验室，没有任何实验技能，进展非常缓慢，不久就看到有两个实验室抢先发表了文章。

于是王永明教授实验室转向研究提高编辑效率，王永明教授说：“在编辑细胞系的时候，人们都用质粒瞬时转染细胞，编辑效率受转染效率和编辑时间的限制。如果用病毒载体编辑细胞，可以长期表达Cas9和gRNA，但是病毒会整合到基因组中，不利于后期实验。我们就想到了用附着体载体（episomal vector）表达Cas9和gRNA。同时在载体上表达嘌呤霉素抗性基因，通过药物筛选去除不含有质粒细胞，转染效率低的细胞也可以实现高效的编辑。如果去除筛选药物，质粒会很快的从细胞中丢失，细胞中不再含有外源基因，在干细胞中最高可以实现100%的编辑。”

附着体载体就是在普通质粒上加了一段病毒来源的序列，使得质粒能够在真核细胞中复制，就像普通质粒在细菌中复制一样，这样就可以长时间表达Cas9和gRNA，延长编辑时间。同时，他们实验室还发明了高通量的测试gRNA活性的方法，一次可以测试数万个，覆盖人的所有基因，这个工作完成后，会极大的方便这个领域的人进行基因编辑。

王永明教授不仅只单单关注CRISPR这一种技术，16年韩春雨发现了号称“第四代基因编辑工具NgAgo”，最初文章报道说NgAgo能够利用磷酸化的单链DNA引导进行基因编辑，于是王永明教授和南通大学的刘东课题组利用NgAgo编辑斑马鱼，发现只能敲低基因的表达，不能编辑，也就是说不能改变DNA序列。虽然，他们当时对NgAgo的敲低原理还不清楚，但后来韩国的一个课题组发现NgAgo能够靶向切断RNA，这部分的解释了其敲低基因表达的原理。对于NgAgo是否能像CRISPR1一样成为强大的基因编辑工具，王永明教授认为“利用NgAgo做基因编辑的前景不太乐观，主要原因是体外生化实验证明它没有DNA酶切割活性。”

CRISPR久经科学家的考验，它的发明成功为基因治疗带来极大的便利，王永明教授对基因治疗的研究也十分感兴趣，目前正在研究利用CRISPR-Cas9技术治疗由于TUBB8基因突变造成的不孕不育症和治疗肥厚型心肌病、长QT综合征的可行性。

据王永明教授介绍基因治疗方式可以分为两种，一种是将细胞从体内分离出来，在体外进行突变纠正，然后再输回体内。比如HIV病毒通过CCR5受体入侵T细胞，科学家把T细胞分离出来，利用CRISPR-Cas9技术将CCR5基因敲除，这样T细胞就不会被HIV病毒侵染了。另外一种治疗方式是将CRISPR-Cas9系统直接导入体内治疗疾病。比如杜氏肌营养不良是由于DMD基因突变造成的，如果将突变的外显子用CRISPR-Cas9技术敲除，基因功能会得到部分的改善，从而达到治疗目的。虽然这些前景看起来十分乐观，但是CRISPR-Cas9技术可能会造成脱靶修饰，带来难以预料的风险。王永明教授表示目前这种应用只限于科学研究，应用到临床还有很长的路要走。

本文来源于：生物谷

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