与CRISPR/Cas系统相爱相杀的抗CRISPR蛋白研究最新进展

CRISPR/Cas系统是目前发现存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种免疫系统，被用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的简称，涉及细菌基因组中的独特DNA区域，也是储存病毒DNA片段从而允许细胞能够识别任何试图再次感染它的病毒的地方，CRISPR经转录产生的RNA序列（被称作crRNA）识别入侵性病毒的遗传物质。Cas是CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）的简称，Cas蛋白像一把分子剪刀那样切割细菌基因组上的靶DNA。

细菌与感染细菌的病毒（噬菌体）之间的生存之战导致了许多细菌的防御系统得到进化，同时噬菌体也针对这些系统进化出了新的拮抗物：抗CRISPR蛋白。CRISPR-Cas系统是细菌保护自己防御噬菌体的一种最常见方法，它在许多细菌体内作为适应性免疫系统发挥重要作用。目前CRISPR-Cas9系统已经越来越广泛地得到科学家们的青睐，用于基因修饰和基因功能研究。

鉴于已知Cas9核酸内切酶在细胞内逗留太久会导致脱靶效应，科学家们正在努力开发Cas9关闭开关在理想的情况下，Cas9会发现完美的靶标，随后一种Cas9抑制剂阻止这种酶发生额外地切割。如今有研究证实病毒进化出的反制措施，即被称作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能够被用来改进作为一种基因治疗工具的CRISPR-Cas9，从而降低可能导致不良副作用的脱靶基因编辑。

在此之前，小编针对CRISPR/Cas系统开展大量的总结和分析，但是未专门针对抗CRISPR蛋白开展过相关的总结。基于此，小编特地针对抗CRISPR蛋白近年来取得的进展，进行一番盘点，以飨读者。

1.Nature：CRISPR-Cas也有天敌！
doi:10.1038/nature15254

近日，来自加拿大多伦多大学的研究人员在著名国际学术期刊Nature上发表了一项最新研究进展，他们在这项研究中首次发现了噬菌体合成的用以抑制细菌体内CRISPR-CAS系统的蛋白质。 在这项研究中，研究人员利用生化和体内研究方法对噬菌体产生的三种抗CRISPR蛋白进行了研究，结果发现每一种蛋白质都通过不同的机制抑制CRISPR-CAS活性。其中两种蛋白通过与CRISPR-CAS复合体内的不同蛋白亚基发生相互作用，利用空间或非空间抑制效应阻断CRISPR-CAS复合体的DNA结合活性。而第三种抗CRISPR蛋白则通过与CAS3解旋酶－核酸酶结合，阻止其被招募到与DNA结合的CRISPR-CAS复合体上。

研究人员利用体内实验证明抗CRISPR能够将CRISPR-CAS系统转变为一个转录抑制因子，首次提出了通过蛋白结合调节CRISPR-CAS活性的模型。

这些抗CRISPR蛋白的多样性序列和作用机制代表它们具有各自独立的进化过程，同时提示可能还会存在其他可能调控CRISPR-CAS功能的蛋白，仍然需要更多研究进行深入探讨。

2. Cell：赞！又发现两种新的抗CRISPR蛋白
doi:10.1016/j.cell.2016.12.009

在刚刚发现几种能够阻断人细胞中的CRISPR-Cas9活性的蛋白（Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.017）之后，来自美国加州大学旧金山分校的Joseph Bondy-Denomy和同事们在一项新的研究中报道了更多的抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）。

研究人员先假设细菌基因组可能含有一种抑制剂来阻止CRISPR切割其自身基因组中的靶标，然后通过在细菌基因组中寻找CRISPR序列和它的靶标而发现这些Cas9抑制剂。确实，Rauch和同事们揭示出几种存在于李斯特菌中的抗CRISPR蛋白，而且这些抗CRISPR蛋白的序列是之前的噬菌体感染中遗留在李斯特菌基因组中的。Rauch说，“正如CRISPR技术是基于细菌的天然抗病毒防御系统开发出来的，我们也能够利用病毒制造出的抗CRISPR蛋白来绕过这些细菌防御系统。”

这项研究发现两种蛋白抑制剂AcrIIA2和AcrIIA4阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶活性，其中Cas9是一种经常用于基因组编辑中的DNA切割酶。

3.Nat Microbiol：微生物利用抗CRISPR蛋白破坏CRISPR/Cas系统
doi:10.1038/nmicrobiol.2016.85

在一项新的研究中，来自加拿大多伦多大学和新西兰奥塔哥大学的一个研究团队发现多样性的细菌物种编码阻断特异性CRISPR/Cas系统活性的基因。通过扫描原噬菌体（即整合在细菌基因组中的噬菌体基因组），来自多伦多大学的Alan Davidson和同事们鉴定出5种新的抗CRISPR蛋白编码基因，而在此之前，他的团队已鉴定出9种。这项最新的研究突出强调了一种学习CRISPR系统如何工作的方法以及一种潜在的开展基于CRISPR的基因编辑的附加工具。相关研究结果于2016年6月13日在线发表在Nature Microbiology期刊上，论文标题为“Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species”。

在当前的这项研究中，Davidson团队扩大对变形菌门（Proteobacteria）内细菌物种基因组的搜寻。鉴于之前鉴定出的这9种蛋白没有共同的序列基序，研究人员寻找与一种假定的转录调节基因具有同源性的序列，这是因为他们发现这种转录调节基因位于所有已知的抗CRISPR位点的附近。

Davidson和同事们然后测试了在质粒中表达的每种假定的抗CRISPR基因是否能够支持噬菌体在携带靶向它的I-E型或I-F型CRISPR系统的细菌内复制。他们又鉴定出4种靶向作用于I-F型CRISPR系统的抗CRISPR基因，以及一种能够阻断I-E型和I-F型CRISPR系统的抗CRISPR基因。

4.mBio：鉴定出新的一组抑制铜绿假单胞菌I-E型CRISPR-Cas系统的噬菌体抗CRISPR基因
doi:10.1128/mBio.00896-14

在一项新的研究中，多伦多大学的Alan Davidson团队证实携带I-F型抗CRISPR基因的一些噬菌体介导对铜绿假单胞菌的I-E型CRISPR-Cas系统的抑制。这些基因并不抑制铜绿假单胞菌的I-F型CRISPR-Cas系统，也不抑制大肠杆菌的I-E型CRISPR-Cas系统他们也在铜绿假单胞菌的非前噬菌体基因组区域（可能是可移动的遗传因子）中鉴定出功能性的抗CRISPR基因。

他们首次证实铜绿假单胞菌的I-E型CRISPR-Cas系统无需基因操纵就天然地具有活性，这与之前描述过的大肠杆菌和其他细菌的I-E型CRISPR-Cas系统形成鲜明对比。

5.Cell：重磅！揭示抗CRISPR蛋白阻断CRISPR系统机制
doi:10.1016/j.cell.2017.03.012

如今，来自美国国家过敏症与传染病研究所、斯克里普斯研究所、蒙大拿州立大学、加州大学旧金山分校和加拿大多伦多大学的研究人员首次解析出病毒抗CRISPR蛋白附着到一种细菌CRISPR监视复合物上时的结构。他们发现抗CRISPR蛋白的作用机制是封锁CRISPR识别和攻击病毒基因组的能力。一种抗CRISPR蛋白甚至“模拟”DNA，让这种crRNA（CRISPR经转录产生的RNA）引导的检测机器脱轨。相关研究结果发表在2017年3月23日的Cell期刊上，论文标题为“Structure Reveals Mechanisms of Viral Suppressors that Intercept a CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex”。论文通信作者为来自斯克里普斯研究所的Gabriel C. Lander和来自蒙大拿州立大学的Blake Wiedenheft。

利用一种被称作冷冻电镜的高分辨率成像技术，这些研究人员发现了CRISPR系统和抗CRISPR蛋白的三个重要的方面。

首先，他们准确地观察这种CRISPR监视复合物如何识别病毒遗传物质以便发现它应当在何处发起攻击。这种监视复合物中的蛋白像握手那样缠绕在细菌crRNA的周围，让这种crRNA的特定片段暴露出来。这种特定片段扫描病毒DNA，寻找它们能够识别的基因序列。再者，这些研究人员分析了病毒抗CRISPR蛋白如何瘫痪这种监视复合物。他们发现一种抗CRISPR蛋白覆盖住crRNA的这个暴露片段，从而阻止这种CRISPR系统扫描病毒DNA。

另一种抗CRISPR蛋白采用一种不同的策略。基于这种抗CRISPR蛋白的结合位置和负电荷，这些研究人员认为它起着模拟DNA的作用，诱导CRISPR结合这种抗CRISPR蛋白，而不是入侵的病毒DNA。

这些研究人员认为这种对抗CRISPR蛋白的新认识可能最终导致人们开发出更加复杂的和更加高效的基因编辑工具。抗CRISPR蛋白可能能够被用于CRISPR系统之中来迅速阻断基因编辑，或者科学家们可能能够降解抗CRISPR蛋白来触发基因编辑。

6.Science子刊：利用抗CRISPR蛋白显著降低CRISPR-Cas9脱靶效应
doi:10.1126/sciadv.1701620

如今有研究证实病毒进化出的反制措施，即被称作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能够被用来改进作为一种基因治疗工具的CRISPR-Cas9，从而降低可能导致不良副作用的脱靶基因编辑。

在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校的研究人员证实最近发现的抗CRISPR蛋白降低脱靶效应多达4倍，就像一种切断开关那样让CRISPR-Cas9完成它的任务之后失去功能。相关研究结果发表在2017年7月12日的Science Advances期刊上，论文标题为“Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic”。论文通信作者为加州大学伯克利分校创新基因组学研究所研究员Jacob Corn博士和来自加州大学伯克利分校的作为CRISPR-Cas9基因编辑发明人之一的Jennifer A. Doudna。

在这项研究中，这些研究人员让CRISPR-Cas9分子利用向导RNA（gRNA）发现、切割和替换导致镰状细胞疾病的血红蛋白编码基因突变体。他们证实一种被称作AcrIIA4的特定抗CRISPR蛋白将这种CRISPR-Cas9分子的脱靶效应降低4倍。它在做到这一点的同时不会显著地降低想要的在靶基因编辑。

7.Nature子刊：浙江大学朱永群实验室揭示AcrF3蛋白抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系统的分子机制
doi:10.1038/nsmb.3269

AcrF3-PaCas3复合物晶体结构示意图

2016年7月25日，国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Structural & Molecular Biology》杂志上在线发表了浙江大学生命科学研究院朱永群实验室题为“Structural Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein AcrF3”的研究论文，研究揭示噬菌体蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系统效应分子Cas3的分子机理。国家蛋白质科学中心的姚德强博士和朱永群实验室博士生王小飞为论文共同第一作者，朱永群教授和助理研究员周艳博士为本文的共同通讯作者。

朱永群实验室建立了PaCas3体外核酸酶酶学实验体系，发现PaCas3具有很好的多种二价金属离子依赖的核酸酶活性。进一步的生化实验揭示AcrF3蛋白在溶液状态下形成同源二聚体分子，以高亲和力的方式与PaCas3特异地结合，有效地抑制了PaCas3体外核酸酶活性。通过解析2.6埃高分辨率的PaCas3-AcrF3复合物的晶体结构，该研究发现PaCas3由一个独立的N端Cas2结构域、HD型核酸酶结构域、SF2型解旋酶结构域(由RecA1和RecA2两个亚结构域组成)、Long linker区以及C端结构域(CTD)所构成。单独的Cas2蛋白被报道在CRISPR-Cas免疫系统的DNA adaptation(DNA适应)过程中发挥关键作用，Cas2与Cas1形成摩尔比2：4的整合酶复合物，将获取的外源DNA插入CRISPR基因座中。PaCas3拥有独立的Cas2结构域，说明PaCas3不同于以往报道的Cas3分子，它同时参与了CRISPR-Cas系统中的DNA适应和DNA干扰两个过程。

在PaCas3-AcrF3复合物晶体结构中，AcrF3以同源二聚体的方式与PaCas3的紧密结合，这与我们的生化实验结果完全一致。单个AcrF3分子呈现由六股α-螺旋组成的双层结构，并通过疏水相互作用、以反向对称的方式形成同源二聚体分子。破坏二聚体中两个分子之间的疏水作用，将导致AcrF3完全丧失了抑制PaCas3体外核酸酶活性的能力。在复合物结构中，AcrF3二聚体结合在PaCas3 的位于Long linker区与CTD结构域之间的凹槽区域，并与PaCas3的HD、Long linker区、RecA2和CTD结构域之间发生了广泛的相互作用。其中，AcrF3与RecA2之间的相互作用完全封闭了PaCas3解旋酶结构域中DNA结合通道的入口，说明AcrF3的结合导致PaCas3不能接触由Cascade呈递来的目标DNA。令人惊讶的是，在复合物结构中，PaCas3解旋酶结构域结合了一个ADP分子，而不是通常活性解旋酶结合的ATP分子，表明AcrF3将PaCas3锁定在非活性的状态。通过进一步的结构分析，该研究还发现AcrF3也阻止了Cascade复合物的Cse1亚基对PaCas3的识别作用，导致Cascade不能招募PaCas3。因此，AcrF3蛋白以同源二聚体为活性单元，通过屏蔽PaCas3对目标DNA的接触、阻断Cascade复合物Cse1亚基对PaCas3的招募作用以及将PaCas3锁定在ADP结合的非活性状态，从而抑制I型CRISPR-Cas免疫系统，发挥其anti-CRISPR活性。

在一项新的研究中，多伦多大学的Alan Davidson团队在一项研究中，发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组中的单个原噬菌体能够抵抗一系列其他类型的噬菌体。因此，他们对铜绿假单胞菌CRISPR系统进行调整以便试图理解这种原噬菌体如何可能影响这种细菌对噬菌体感染的敏感性。他们发现铜绿假单胞菌的I-F型CRISPR系统仅仅阻止某些类型的噬菌体的感染。通过搜寻噬菌体基因组，他们发现5种独特的基因，每种都有抗CRISPR活性。

9.哈工大黄志伟课题组最新Nature！揭示魔剪CRISPR“抑制开关”分子机制
doi:10.1038/nature22377

4 月 28 日，哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授课题组在《自然》（《Nature》）在线发表了题目为《Anti-CRISPR 蛋白抑制 CRISPR-SpyCas9 活性的分子机制》（Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein）的研究论文。

早先的研究发现一类来自于 Listeria monocytogenes 前噬菌体的 Anti-CRISPR 基因 AcrIIA4 等在细胞内能够抑制 SpyCas9 的基因编辑活性，然而这些 Anti-CRISPR 基因抑制 SpyCas9 活性的分子机制并不清楚。

为了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能够直接结合 SpyCas9，课题组首先建立体外生物化学研究系统，研究发现 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接结合 SpyCas9-sgRNA 复合物，有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和结合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用，而和单独 SpyCas9 并没有相互作用；进一步实验发现 AcrIIA2 或 AcrIIA4 能够直接抑制 SpyCas9 介导的目的 DNA 的剪切。

为了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子机制，课题组纯化出 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物，并通过结构生物学研究方法解析了 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物的晶体结构，该复合物结构揭示 AcrIIA4 蛋白构象是一个新的折叠，它结合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC 三个结构域形成的凹槽区域。该凹槽区域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA 的结合位点；另外来自 AcrIIA4 的β1 折叠片前的 Loop 与 RuvC 活性位点接触也加强了 AcrIIA4 对 SpyCas9 的抑制作用。上述结构观察结果显示 AcrIIA4 和底物 PAM DNA 竞争性结合 SpyCas9，AcrIIA4 比底物 PAM DNA 具有更强的亲和力的实验结果进一步支持了结构观察的结果。接下来的生化实验结果进一步证实 AcrIIA4 结合 SpyCas9 后抑制底物 PAM DNA 结合 SpyCas9，从而拮抗 SpyCas9 的活性。

10.Cell：首次发现CRISPR/Cas9基因编辑的“关闭开关”
doi:10.1016/j.cell.2016.11.017

CRISPR/Cas9基因组编辑正快速地引发生物医学研究变革，但是这种新技术迄今为止并不是非常精确的。这种技术能够在基因组中无意地产生过多的或者不想要的变化，产生脱靶突变，从而限制了它在治疗应用中的安全性和疗效。

如今，在一项新的研究中，来自美国马萨诸塞大学医学院和加拿大多伦多大学的研究人员发现首批已知的CRISPR/Cas9活性“关闭开关”，从而为CRISPR/Cas9编辑提供更好的控制。

马萨诸塞大学医学院RNA治疗研究所教授Erik J. Sontheimer博士、多伦多大学分子遗传学教授Alan Davidson博士和多伦多大学生物化学助理教授Karen Maxwell博士鉴定出三种自然产生的抑制Cas9核酸酶的蛋白。这些被称作抗CRISPR的蛋白具有阻断Cas9切割DNA的能力。