除草剂抗性农作物育种研究进展
杂草危害农作物生命活动。在农作物生长过程中，不仅与作物争夺光照、生长空间与营养物质等，还会传播病虫害，释放有毒物质造成粮食减产。中国常年杂草发生面积接近 0.97 亿 hm 2 ，相当于作物种植面积的 80%。杂草引起作物减产，造成巨大损失，杂草防治极为关键，最常用的是喷施除草剂，省时省力，效果明显，但是，除草剂使用不当必然对农作物造成一定伤害，极容易导致对除草剂敏感的作物死亡。因此，既要高效地消灭杂草，又不使作物受到药害，可以通过新型除草剂产品的研发和抗除草剂作物品种的培育两种途径实现。
研发新型除草剂的成本很高，而培育抗除草剂作物品种相对比较经济，费用一般不超过研制新除草剂费用的 5%。发掘农作物除草剂抗性基因、探索抗性育种新途径、培育抗除草剂农作物新品种成为作物遗传育种的重要方向之一。
一、农田杂草的类型及我国主要农作物田间杂草
1、农田杂草的类型
农田杂草有单子叶杂草和双子叶杂草。单子叶杂草与双子叶杂草除了子叶数不同外，其叶片上的脉络和气孔、根系形态以及花的结构也有一定的区别：看麦娘、马齿苋、狗尾草等双子叶杂草叶片脉络多为网状，气孔排列不规则，直根系，通常有 4或 5 个花基数。而单子叶杂草如马唐、牛筋草、香附子等是平行脉叶片，须根系，花基数通常为 3 个。一年生和多年生杂草是依据田间杂草的繁育特性进行分类的。苍耳、稗等一年生杂草，其生命周期从种子萌发到植株死亡在 1 年内完成。香附子、车前草等多年生杂草寿命超过 2 年，该类杂草一生中能多次开花结实。开花结实后地上部分会死亡，地下器官存活越冬。次年春天，地下营养器官长为植株。
2、我国主要农作物田间杂草
我国玉米田间杂草近百种，其中一年生杂草发生量较大，占总发生量的 80% 以上，多年生杂草不到 20% 。其中影响严重的杂草主要有马齿苋、狗尾草、牛筋草和马唐等。小麦田间杂草接近200种，其中，一年生杂草发生量仍占较大比例，二年生杂草和多年生杂草所占比例较小。牛筋草、马唐、香附子和看麦娘等对麦田影响较重。水稻田间杂草种类数与小麦田接近，其中，眼子菜、水莎草、鸭舌草和矮慈姑等杂草分布较广、为害重。
二、除草剂主要类型及其作用机制
1 、除草剂主要类型
依据化学结构可将除草剂分为 4 类：（1）磺酰脲类除草剂。该类除草剂的化学结构包括 3 部分：疏水基体、电子传递体以及活性基体，即芳香基、磺酰脲桥和杂环。不同磺酰脲类除草剂的官能团不同。（2）酚类、醚类除草剂。酚是羟基与苯环直接相连形成的有机化合物。酚类除草剂，如五氯酚钠苯环上的 5 个氢原子被氯取代羟基上的氢被钠取代。醚类除草剂中的醚一般是以苯环与醚键相连而成的芳香醚。（3）苯氧羧酸类除草剂。苯氧羧酸与醚类、酚类的区别在于苯环上的氢被氯、羧酸或羧酸衍生物取代，由此产生不同的苯氧羧酸类除草剂。（4）有机磷类除草剂。有机磷类除草剂是由亚磷酸酯、硫代磷酸酯或含磷杂环有机化合物构成的除草剂。
按作用方式将除草剂分为选择性和非选择性除草剂。选择性除草剂对非目标作物并无伤害。如 2-甲-4-氯、2，4-D 丁酯能选择性杀死一些双子叶杂草，而对单子叶作物无伤害。非选择性除草剂是指选择性小甚至无选择性的除草剂。该类除草剂作用于全部植物，如草甘膦、百草枯等。
根据除草剂在植物体内移动方式的不同分为内吸型和触杀型除草剂。杂草的各个器官将药剂吸入体内后运输到植株其他部位继而破坏杂草体内生命代谢活动达到防治杂草目的的属内吸型除草剂，该类药剂一般见效缓慢，如草甘膦。触杀型除草剂使感染到除草剂的植株发生损伤而死亡，而不经过植株体内传导。杂草地上部分直接暴露在除草剂中，因此损伤严重，而根部则避免了伤害，因而此类除草剂主要用于防除一年生杂草，如除草醚、敌稗等。
2、 除草剂的作用机制
1、抑制氨基酸生物合成
在高等植物体内，乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）对支链氨基酸如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成具有关键作用。而该类氨基酸生物合成抑制型除草剂，如磺酰脲类除草剂通过抑制 ALS 的活性，导致支链氨基酸合成受阻，进而影响蛋白质的合成，致使有丝分裂指数下降，最终使组织失绿、黄化，植株逐渐死亡达到除草的目的。
2、 抑制光合作用
光合作用中光反应和暗反应分别发生在光合系统Ⅰ和光合系统Ⅱ中。如均三氮苯类除草剂等通过阻滞光和系统中电子的传递来抑制光合作用，使得 CO 2 固定、NADP 的还原以及ATP 合成受阻，叶片进而失绿黄化，最终杂草由于缺乏营养而枯萎死亡。
3、 抑制乙酰辅酶Ａ羧化酶合成
乙酰辅酶Ａ羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACCase）在脂肪酸合成反应中起到控速酶的作用。丙酮酸和乙酸在不同酶的催化作用下合成乙酰辅酶Ａ，然后被 ACCase碳化形成丙二酸单酰辅酶 A（malonyl-CoA），最后在脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，FAS）催化作用下形成脂肪酸（fatty acid，FA）。抑制乙酰辅酶Ａ羧化酶合成类除草剂可阻断脂肪酸的生物合成中辅酶Ａ到单酰丙二酸辅酶 A 的合成以行使除草功能，但该类除草剂的施用会导致杂草产生抗性。
4、 抑制色素合成
原卟啉原氧化酶（protoporphy-rinogen oxidase，PPO） 抑 制 型 除 草 剂 近 年 来 发展十分迅速。该类除草剂通过使植株中原卟啉（protoporphyrin IX）累积、脂质过氧化、叶绿素合成受阻等典型的生理变化起到防治杂草的目的。二苯醚类和环酰胺类除草剂作用机理的关键在于原卟啉Ⅸ的积累。原卟啉原氧化酶可将原卟啉原 IX 氧化为原卟啉 IX，然而除草剂会比底物（原卟啉原Ⅸ）对原卟啉原氧化酶更敏感，以此占据原卟啉原氧化酶的活性中心。最终导致原卟啉原Ⅸ的累积，累积的原卟啉原Ⅸ泄漏至胞质中并转化为原卟啉Ⅸ。叶绿体中原卟啉Ⅸ经过一系列催化反应可合成叶绿素，泄漏至细胞质后则在光作用下将 O 2 催化为单线态氧以及具毒性氧基。单线态氧会引发不饱和脂肪酸的过氧化进而损伤胞膜。叶绿体中的光合色素由于类囊体膜被毒性氧基破坏造成渗漏，继而引发光分解，脱色作用使组织白化，杂草将无法存活。
三、农作物除草剂抗性机制
1、 修饰除草剂靶标蛋白以降低对除草剂的敏感性
喷施除草剂后作物生命活动仍正常进行。ALS促进缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸这 3 种支链氨基酸的生物合成，其活性受到抑制将使蛋白质合成受阻而导致植株死亡。乙酰乳酸合酶中单个氨基酸的改变会钝化作物对磺酰脲类除草剂的敏感性。目前，已获知的烟草（脯氨酸变为谷氨酸或丙氨酸）、拟南芥（脯氨酸变为丝氨酸）、大豆（脯氨酸变为丝氨酸）对该类除草剂中的氯磺隆的抗性就是单个氨基酸改变的结果。在对水稻两个除草剂抗性植株进行 ALS 活性分析中发现突变后的 ALS 对不同种类除草剂的耐受性比野生型提高约 1 万倍。
2、提供降解除草剂的降毒酶
土壤微生物可将多类除草剂在其发生作用前分解成微毒或无毒成分。依据微生物这种作用机制将解毒酶引入植株体内可行使解毒功能而达到抵抗除草剂的功能。该种抗性机制最大的优点是不会增加作物的代谢负担，因此，抗性作物的产量和质量不会受到影响。
3、 靶标蛋白过量表达免受除草剂抑制
将除草剂草甘膦靶标蛋白酶EPSP（5-endpyruvy/shikimate-3-phosphate）过量表达可显著增强作物对除草剂的抗性。且基因的自我复制以及转录水平的调控均可提高 EPSP 的表达量。研究证明：植株对草甘膦抗性正比于 EPSP 的活性。
四、作物抗除草剂育种研究进展
1、抗除草剂作物常规育种研究进展
1）杂交法与自然选择培育抗除草剂作物
科学家依据杂草对除草剂的抗性机制已培育出多种抗除草剂作物。如今已有玉米、大豆和烟草等近 20种除草剂抗性作物是通过非转基因手段培育的，育种家通过筛选得到抗性作物品种，然后将其与优良的栽培品系进行杂交获得集聚双亲优良性状的除草剂抗性作物。基因的分离重组产生各种变异类型，从中选择目的性状，以此培育优良杂种。自然选择和杂交法培育抗性作物很好地利用了植物中的天然耐性基因以及杂种优势，但也存在工作量大、周期长等弊端。从大量作物中找到天然抗性的植株是培育除草剂抗性作物的关键，同时这也是进行其他研究试验的前提。
2）诱变育种培育抗除草剂作物
诱发植物产生突变的物质称为诱变剂（mutagen）。诱变育种（induced mutation breeding）是通过一定理化因素诱导作物产生各种不定向突变，然后再从中选择出目标性状的育种过程。与其他育种方式相比，其优势在于缩短了育种年限且后代性状稳定、育种周期短，可以改良甚至产生单个基因控制的独特性状。
实验室常用到的化学诱变剂主要有 EMS、叠氮化钠（NaN 3 ）碱基类似物等。诱变育种中最常使用诱发点突变的 EMS 诱变剂，该诱变剂多产生显性突变因此易于进行突变体筛选。此外物理诱变手段如离子束、超声波、微波、射线等需要放射源，成本较高且常导致一些非预期的有害突变，所以应用较少。化学诱变主要有：（1）花粉诱变。石蜡油花粉诱变技术以石蜡油、EMS 分别作载体剂和诱变剂处理未污染的花粉。授粉后再用除草剂对后代进行抗性筛选，最后获得抗性品种。咪唑啉酮类除草剂抗性玉米的获得主要采用此育种方法。20世纪 80 年代，Newhouse 等诱变处理细胞株系，从中成功筛选出 3 株抗性株系并育成咪唑啉酮类除草剂抗性小麦品种。（2）种子诱变。种子诱变比花粉诱变更加容易操作。将种子直接浸泡于诱导药液中便可产生不同程度突变。经过药剂处理的种子长成植株 M1，但 M1 含较多的嵌合体和隐性突变，且变异主要为不能遗传给后代的生理伤害变异，所以在 M1 中筛选是无效的。M2 代中抗性性状会由于生殖细胞的形成过程中有突变类型的参与而出现分离，将喷施除草剂筛选到的突变体进行几代纯化后能得到除草剂抗性品种。Newhouse 等以NaN 3 为诱变剂诱变小麦材料，通过系谱法对突变体小麦逐代选择，最终从近万株的 M2 中成功获得了咪唑啉酮类除草剂抗性小麦品系。（3）其他部位诱变。植物的外植体以及多数营养或生殖器官均能被诱发产生突变，值得注意的是细胞水平的诱变更具应用潜质。
3）植物组织培养法培育抗除草剂作物
近年来，植物组织培养技术在抗除草剂作物的培育过程中发展较快，应用较多。将离体的植物器官或组织在添加一系列不同浓度除草剂的培养基中进行人工培养，诱发其产生愈伤组织。愈伤组织对除草剂十分敏感，容易产生突变体，筛选后的突变体再生成植株得到抗性新品种。有试验研究表明，具有唯一靶标的除草剂更易诱导愈伤组织发生突变而获得抗性再生植株。所以，植物组织培养法培育除草剂抗性作物主要倾向于如靶标单一 ALS 抑制剂类除草剂。采用植物组织培养法培育除草剂抗性作物，如烟草、大豆、玉米，虽已取得较大突破，但其发展历史较短，因此在技术和应用上并不成熟，有待进一步完善。
2、转基因抗除草剂作物育种研究进展
1）除草剂抗性基因 按作用机理的不同将除草剂抗性基因分为两类：（1）除草剂靶蛋白突变基因。如突变除草剂靶蛋白 ALS 基因的表达将钝化植株磺酰脲类除草剂的化学作用，即使喷施除草剂后生命代谢活动依旧正常进行。（2）编码修饰除草剂的酶或酶系统基因。从微生物如土壤细菌Klebsilla 中可以克隆出一种表达水解 oxynil 类除草剂的晴水解酶基因 bxn 。这类基因编码的酶或酶系统会将除草剂在发挥药性前将其降解成微毒或无毒成分。
2）转基因除草剂抗性作物研究概况
在分子生物学的发展过程中，通过基因工程手段培育的多个除草剂抗性作物品种已广泛应用于农业生产中。截至 2009 年，全世界抗除草剂转基因作物种植面积占全部转基因作物种植总面积的 60%，总面积超过 8 300 万 hm 2 ，到 2010 年已达到 1.48 亿 hm 2 。其中，除草剂抗性转基因作物仍占较大比例，成为应用最广泛的转基因性状。1983 年培育出的抗除草剂烟草是第一例转基因作物。截至目前，已经推广种植的抗除草剂作物主要有玉米、水稻、大豆、油菜、棉花等。在这些抗性作物中居于首位的是大豆，其次是玉米。农杆菌介导转化法和基因枪介导转化法是抗除草剂抗性基因导入受体的两种最常用方法。农杆菌介导转化法是利用转基因技术培育除草剂抗性作物中应用最为广泛的外源基因导入法，该方法操作简单，转化率高，且转基因重排少，拷贝数低。但该方法也具有一定的局限性，一般只感染双子叶植物，对于禾谷类单子叶植物的转化效率低。基因枪介导转化法的原理是借助燃料爆燃、高压气体或高压放电产生的能量驱动金粉粒以一定的速度进入细胞的一种方法。基因枪法没有宿主的限制且易于操作，适用于用农杆菌介导转化无法实现的作物。丰富的除草剂抗性作物种类的培育得益于不断发掘的除草剂抗性基因以及日趋成熟的遗传转化技术。培育转基因除草剂抗性作物的主要价值体现在以下几个方面：（1）提高除草效果、降低除草成本。市场上广泛使用的草铵膦和草甘膦除草剂杀草谱广，属非选择性除草剂，因此应培育对该类除草剂有抗性的转基因作物。（2）利于采用保护性耕作。美国自引入除草剂抗性大豆以来无耕作大豆播种面积提高了近三分之一。保土耕作技术的推广不仅减少了水土流失，同时还提高了水的使用率以及土壤中有机质的含量。（3）有助于采用窄行间距种植。
除草剂抗性转基因大豆的行间距缩至原来一半，合理密植加快了作物顶冠闭合，从而增强了作物的生命力，达到高产目标。除此之外，与其他除草剂相比，草铵膦和草甘膦对环境的污染较轻，在土壤中极易降解，所以流向地表水的可能性较小，不会对水环境造成威胁。
3）除草剂抗性转基因作物的安全性评价问题
尽管除草剂抗性转基因作物有诸多好处，但其安全性评价问题突出，是制约其发展的主要因素。以除草剂抗性转基因玉米为例，其安全评价主要有两大方面。
一是食品安全。食品安全问题主要有过敏性问题、毒性问题、对抗生素产生抗性问题以及营养问题等。若转基因玉米中转入基因所表达的蛋白有致敏性或者因转入基因的表达而产生新致敏原都会使其产生致敏性。所以，转基因玉米安全性评价问题的关键之处在于其是否有致敏性。再者，转基因插入位点的不确定性会导致原有的受体基因改变表达甚至失活，同时在自然情况下处于“沉默”状态具有毒素的基因存在被激活的风险。转基因或基因操作手段可能会使转基因受体植株在经历漫长的进化以及驯化的过程中再次激活这些表达超出预期毒性成分的毒性基因。其次，将某种抗生素抗性基因构建到转基因表达载体中可进行后期筛选。但是，基因水平转移使肠道内细菌有获得抗生素抗性的可能。尽管 FAO/WHO 专家组认为动物体摄入抗性基因后，其水平转移到肠道细菌并对动物产生不利影响的概率很小，但仍需对其潜在的危险性进行评估。
二是生态安全。转基因植物的主要生态安全问题：（1）转基因逃逸与基因漂移；（2）抗虫或抗病转基因对环境中非靶标生物的影响；（3）转基因植物大规模长期种植对土壤生物群落的影响；靶标生物对转基因植株抗性的进化。其中，转基因作物基因漂移备受关注。花粉、种子和无性繁殖器官都会介导转基因漂移。而转基因漂移会使非转基因种子混杂转基因种子，降低种子纯度。并且，传统品种种子中混杂了转基因种子会破坏传统品种种质资源的完整性。同时，植物与野生近缘种的生态适合度和入侵能力可能会被经过遗传修饰的转基因所改变。如果大量的转基因转移到野生种群体中，它们便会不断取代野生群体物种中的等位基因最终导致群体遗传多样性的丧失。具有抗逆性的基因漂移到与作物亲缘关系较近的杂草中会引发杂草化问题，杂草获得较高田间适应能力以及入侵能力将使得对杂草的管理和防控更加困难，最终造成更大的经济损失。因此转基因作物需要受到严格监管。
五、基因编辑新技术方法培育抗除草剂作物
基因组编辑技术通过两部分起到定向编辑基因组的作用。首先是具有导向功能的 gRNA 特异识别基因组序列位点，其次是定点切割的核酸酶。二者结合才能发挥定向切割，产生双链断裂。细胞通过同源重组或非同源末端连接两种不同修复机制对 DNA 产生的断裂双链进行修复。基因组编辑中行使切割功能的核酸酶有锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs），类转录激活子效应蛋白核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN），以及 CRISPR/Cas9 系统。2009 年，Townsend 等成功通过 ZFN 对烟草原生质体中两个 ALS 基因实现了同源重组编辑，获得抗性烟草。CRISPR/Cas9技术易操作、成本低、效率高的优点备受生物技术工作者的青睐。经过改造的 CRISPR/Cas9 系统被迅速地应用到拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦和玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。国外已有研究者通过构建 CRISPR/Cas9 系统将玉米 ALS2 基因第 165 位氨基酸——脯氨酸通过引入修复模板，经同源定向修复为丝氨酸以降低磺酰脲类除草剂对植株体内支链氨基酸生物合成的阻碍，从而产生磺酰脲类除草剂抗性。将 gRNA 与Cas9 构建到同一载体中将提高转化效率，试验数据也证明了 CRISPR/Cas9 系统在玉米中高效的基因敲除、插入与定点编辑效率，后续分析发现基因敲除、插入和编辑可以稳定遗传给后代并符合孟德尔分离规律。相似的机制在其他作物如拟南芥和水稻中是否有效？通过 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术是否可以将多个分离的点突变同时引入到植物基因组中？最近的研究报告中：研究者以两个 gRNA 代替单个 gRNA，将其与 Cas9 以及用于同源修复的模板构建到同一载体中并经过基因枪转化水稻愈伤组织，结果证实这是一种在水稻 ALS 基因中引入不连续点突变的有效方法。笔者从事基于玉米的基因组编辑技术工具的优化与应用，以实现玉米基因组高效准确的编辑。其中，除草剂抗性基因的编辑也是其研究内容的一部分。
六、农作物除草剂抗性育种的发展趋势
常规育种通过杂交可以获得兼具双亲优良性状的品种，在一定意义上实现了稳产、高产的育种目标，但常规育种周期太长，不论在数量还是质量上还难以满足人类日益增长的粮食需求。转基因生物技术作为科技进步的产物已在多个领域广泛应用。但是在作物育种中，外源基因被引入受体植物，且基因在作物基因组中并没有特定的插入位点。由此带来的转基因作物的生物安全性问题依旧备受争议，成为制约其发展的主要因素。目前，CRISPR/Cas9 作为一种新兴的基因组编辑技术可对基因组特定位点进行 DNA 的插入与删除以及某个或某些碱基的替换等操作。作为作物分子育种新途径，它的关键之处在于应用回交或自交的方式可筛选出经过基因组定点编辑却不含转基因片段的株系。因此，农作物除草剂抗性育种有望通过基因组编辑技术取得更好的成果。
文章已授权基因农业网转载
本文转载自：《作物杂志 Crops》 2017（2）：1-6
作者：李燕敏 祁显涛 刘昌林 刘方 谢传晓
作者单位：中国农业科学院作物科学研究所 安徽农业大学生命科学学院
