牛角无需人工去除，基因编辑培育无角牛
牛角是牛科动物特有的，用来防御外界的攻击，但是在现代化养殖中容易造成人员伤亡，通常，舍饲牛场在犊牛出生一周之内，就会利用物理或化学方法进行去角，而人为除角又会违背动物福利且浪费人力物力。科学家研究了自然界中牛的无角和畸形角性状，牛角的发生发育机制，确定角形成的候选基因及牛无角性状调控机制，利用基因编辑针对性地培育出了无角牛，饲养员再也不用担心喂牛时受伤了。
基因编辑是怎么做到这一点的呢，先来了解这几个问题：
牛角是怎么形成的?
控制牛角的基因是什么？
牛的无角、畸形角和正常牛角的基因有什么不同？
1、 牛角的形成及发育
要培育无角牛，首先要清楚牛角的形成及发育。牛角属于洞角，由角质鞘和骨心组成，其长度和强度在不同个体和品种中存在较大差异。角质鞘是角最外层的结构，属于皮肤衍生物，具有角斗及保护骨心的作用。骨心是里面的空腔结构，起源于牛角芽真皮，里面有类似于皮肤的真皮乳头并有血管结构，后骨化的皮下组织即前额骨头向上生长形成角的原基，然后就地溶解与头盖骨融合。因而，角的发育是起源于上胚层和中胚层2个胚层的许多组织分化和重塑的结果。在胎儿长5．2 cm 时，角芽区真皮变厚，后形成螺纹状，出现毛囊、汗腺和皮脂腺;胎儿体长 61 cm 时，真皮进一步加厚，并伴随附属器官萎缩。
通过对各个不同发育时期的胎儿角芽区和前额皮肤区进行组织学研究，研究人员给出了牛角的发育过程：
牛胎儿70 日龄时，就出现了角芽区与前额皮肤区的分化，角芽区真皮较厚，角质细胞有液泡；
牛胎115 天时，角芽区真皮组织中出现了加厚的神经束；
155 天时：出现皮脂腺
172 天：前额皮肤区出现
212 天时，角芽区上皮基本分化完全
268 天时：前额皮肤区完全分化
与角芽区相比，前额皮肤区一直没有出现增厚的神经束，只有正常的神经纤维。对角芽区 115天出现的神经束进行神经特异性烯醇酶(NSE)染色，发现其为 NSE 阳性，证明角芽区较早的出现了神经组织。而对无角胎儿的组织学分析显示，无角个体的角芽区相应位置和前额皮肤区的发育过程完全一致，在各个时间点都不存在差异。
如图 1所示，早期阶段(2～3个月) 角芽几乎不可见，很小，淡黄色的斑点。
3～4个月时形成锯齿状，随后角芽在一个锯齿状区域可见，但是没有毛囊(5～6 个月)，晚期阶段(7～8 个月)角芽完全发育，出现浓密毛囊，会形成毛发。
2、 牛无角及畸形角基因型分析
（1） 无角
Lvica 和 Aurelie 等对无角欧洲牛和有角牛通过高密度 SNP 基因分型和高通量测序，鉴定了引起牛无角表型的遗传变异。发现导致黑白花奶牛和非荷斯坦牛的无角突变是不同的。黑白花奶牛无角性状的候选突变是牛 1 号染色体 80 128bp(1 909 352 ～ 1 989 480 bp) 的重复以及 3 个SNP 导致，将黑白花奶牛的无角突变称为 P F 。而非黑白花奶牛的无角性状候选突变为牛 1 号染色体上 202 bp(1 705 843～1 706 045 bp)的重复，并替换了原有的 10 bp(1 706 051～1 706 060 bp)，将非黑白花奶牛的无角突变称为 P C 。这些突变都不位于已知的基因上。
随后，Wiedemar 等对西门塔尔牛和荷斯坦牛的无角性状进行了分析，发现大多数西门塔尔牛无角突变是牛 1 号染色体1 706 054 后10 bp 处插入了208 bp(1 705 837～17 066 044)，并伴随其后 6 bp 的缺失;大多数荷斯坦牛的突变有 31 个 SNP、1 个 1 bp 的缺失、1个 5 bp 删除伴随 12 bp 插入和 1 个 80 kb 的基因组重复。该重复是 80 128 bp(BTA1:1 909 352～1 989 480)，并伴随 2 bp 缺失。
Wiedemar 等鉴定出的 P C 和 P F 突变与 Lvica和 Aurelie的研究结果基本吻合，但是 Wiedemar 等发现 PF 也存在于少数西门塔尔牛中，而 P C 也存在于少数荷斯坦牛中;还发现有几头无角个体并不存在这两种突变。对大通牦牛无角性状的突变研究发现，其无角突变同样发生于 1 号染色体上，但是与黑白花牛和其他牛的关键区域并不重合。这些结果可能意味着，无角性状基因还可能存在于其他位点且存在其他突变方式，还需要进一步研究。另外研究者发现，无角性状只伴随着不规则的睫毛 － 眼睑表型，在一些无角突变群体中，存在纯合突变雄性个体外阴缺陷症状，但这一性状并不完全与无角性状相关，而仅存在于少数个体中。
（2） 畸形角(scurs)
Scurs 是 2 型畸形角综合征，是牛科动物中存在的一种角畸形症状。患病个体角形态各异，但都不能发育成正常的角。虽然与正常角发生位置一样，但是畸形角是直接与表皮相连，而不像有角牛那样角与头骨密切连接。畸形角在额骨上有山脊状骨沉积，该沉积与角大小呈负相关;其骨中心没有气腔，且头盖骨和角的骨中心充满软组织，具体形态见图 2。
Aurelien 等通过对 scurs 群体进行 SNP分析，发现引起该症状的关键位点在牛 4 号染色体上 1．7 Mb 区域内，原因是 TWIST1 基因 1 号外显子上的 10 bp 重复(148～157 bp)。该重复会导致移码突变，使得TWIST1 基因的 2 个功能性结构域完全失活，从而导致该基因失活。进一步研究发现，患病个体基因型均为杂合，而正常个体均为野生纯合型，证明该基因纯合突变是致死的。Wiedemar 等证明杂合的无角牛在其 1 号染色体上同时 存 在1768587 C＞A 这一 SNP 时也会出现畸形角表型。
（3）无角和多系统综合征(PMS)
无 角 和 多 系 统 综 合 征是在研究一个夏洛莱公牛后代群体过程中发现的一种无角并伴随着多种系统疾病的症状。临床症状为:角完全发育不良、面部畸形、生长延缓、长期腹泻、卵巢发育失败以及神经和心脏异常。PMS 还有性别比例失调现象，雄性胎儿在妊娠期即死亡。通过全基因组测序发现其父本在 2 号染色体上存在一个 3．7Mb 的缺失，该缺失包含 AＲHGAP15、GTDC1 和ZEB2 基因，进一步研究发现 ZES2 基因缺失是造成无角多系统综合征的主要原因。
3、 影响牛角发育相关基因
牛角发育是一个复杂的调控过程，其发育调控的具体机理还不清楚。根据有角、无角以及畸形角个体之间的基因表达差异，筛选到一些参与角发育过程的基因。其中 TWIST1 缺失会引起角畸形，所以 TWIST1 是参与角正常分化的关键基因。而引起牛无角和多系统综合征的是 GTDC1、ZEB2 和 AＲHGAP15 基因的最后一个外显子;qＲT-PCＲ 结构表明，这 3 个基因在 PMS个体中表达量均明显下降，其中 ZES2 缺失是引起 PMS 的关键基因。TWIST1 和 ZES2 都是上皮向间质细胞转化的关键因子，提示上皮向间质细胞转化是角形成和发育的关键过程。
对无角和有角牛个体角芽区以及相应前额皮肤区基因表达差异的研究显示，OLIG1、OLIG2、C1H21orf62、ＲXFP2 和 FOXL2 在无角和有角个体以及 角 芽 区 和 前 额 皮 肤 区 表 达 有 差 异，LOC100848215 在有角个体角芽区高表达，一个LincＲNA 在无角个体角芽区特异性高表达，证明这些基因参与角芽的发育与分化。
转录组分析表明，有角和无角个体差异基因参与的信号通路主要是细胞连接和上皮发育的相关通路，而无角和畸形角个体差异基因主要参与细胞外基质重建过程。在这些差异表达基因中，OLIG1、OLIG2 和 C1H21orf62 位于 1 号染色体上鉴定出的无角性状区域内，而 ＲXFP2 和 FOXL2 被发现分别在瑞士绵羊和山羊无角性状中起关键作用。
4、 通过基因编辑手段培育无角牛
Tan 等通过 Talen 技术，以牛 1 号染色体上重复 202 bp(1 705 843～1 706 045 bp )的无角安格斯牛这一区间序列为模板，得到了经基因编辑的荷斯坦牛胎儿成纤维阳性细胞。随后通过体细胞核移植技术成功获得了基因编辑无角荷斯坦奶牛。通过检测，这些基因编辑牛都无角，且不存在其他症状。这一研究证明，通过基因编辑手段将无角位点鉴定出的突变引入有角牛成纤维细胞中，可以得到无角个体，为无角牛的培育提供了方法。
5、基因编辑无角牛的展望
通过群体 SNP 分析及鉴定，发现无角性状是一种由于基因突变导致的性状。但是在不同品种牛中导致无角的突变是不同的，而且鉴定出的突变位点几乎不存在已经注释的基因，所以对于引起无角性状的候选基因并不能确定。因此，还不能清楚的了解控制牛角生长发育的相关信号通路，还需要更多深入的研究来认识角的发育机制。
但是从发育过程进行分析可知，角是皮肤衍生物，是外胚层与中胚层相互作用形成的，其中伴随着上皮和间充质细胞的相互诱导，以旁分泌诱导信号为主，所以研究者认为参与上皮和间充质细胞相互诱导的信号通路在角发生过程中起重要作用，包 括 Wnt 信 号 通 路、Notch 信 号 通 路、Hedgeheg 信号通路以及 BMP 信号通路。而无角性状也一定与这些信号通路密切相关，在未来的研究中，可以深入研究无角个体中这些信号通路的变化情况，为牛角发育的信号通路研究提供更多思路。
随着对无角性状相关突变的研究进一步深入，可以通过基因编辑手段人工培育无角基因编辑牛。研究者已经将肉牛 P C 突变成功引入荷斯坦奶牛中获得无角奶牛，那么未来的研究也可以将奶牛 P F 的突变通过基因编辑手段引入肉牛乃至牦牛中生产无角牛。随着研究的不断深入，还可能在不同品种的牛中发现新的候选突变基因，这些新的突变也可以作为基因编辑模板培育不同类型的基因编辑牛。从这些发现的候选突变中选择操作简单，且突变个体除无角外完全正常的突变形式作为基因编辑模板，可以大批量培育无角个体，实现产业化养殖。
注：文章有改动，经基因农业网编辑，原标题：《牛无角性状研究进展》
作者：谷明娟 高 丽 王丽荣 李光鹏 ：内蒙古大学生命科学学院，哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室
文章来源：《生物技术进展》2017 年 第 7 卷 第 3 期 177～181
原文链接：www.swjsjz.cn:8080/Jwk_swjsjz/CN/abstract/abstract496.shtml
