Plant Biotechnology Journal:华中农大张献龙研究组发表基因组编辑和抗
近日，国际期刊《Plant Biotechnology Journal》在线发表了华中农业大学棉花研究团队有关CRISPR/Cas9技术在异源四倍体棉花中的应用获得新进展，相关成果题为《High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system》。依赖于团队高效的遗传转化平台，该研究拓展了 CRISPR 技术在多倍体作物中的应用，为棉花功能基因解析提供重要的技术手段。论文共同第一作者为博士生王鹏程和硕士生张军，张献龙教授和金双侠教授为论文的共同通讯作者。
自2013年在真核生物中成功应用以后，CRISPR/Cas9系统成为生命科学研究的关注热点和近年来最受欢迎的基因组编辑系统。该系统具有稳定性强、效率高和操作简单的特点。利用 CRISPR/Cas9 技术能够成功实现基因组水平的基因敲除，基因转录调控和修饰。目前该技术广泛应用于动物细胞，植物中在水稻、拟南芥、玉米等模式作物中应用较多，而在多倍体植物，如棉花，油菜中的应用较少。原因在于目前生产上种植的棉花是异源四倍体，有 52 条染色体，基因组庞大、复杂(2.5 Gb，相当于拟南芥基因组大小的 20 倍，水稻基因组的 6 倍)，同源重复序列多(70% 左右)，同一基因也具有多个拷贝，很难获得有效的单基因突变体。目前在棉花中常规的基因功能研究手段是 RNAi 技术，该技术往往造成同源基因(基因家族)的沉默表达而产生非预期的表型，同时 RNAi 技术往往对靶标基因沉默不彻底，后代中也出现沉默效应不稳定，甚至消失的情况，因此在棉花中开发新型的功能基因组研究手段，势在必行。
棉花团队从2013年开始，就在棉花中开始了基因编辑的研究工作，包括构建了适用于棉花遗传转化体系的 TALEN 载体及三套 CRISPR-Cas9 系统。在此研究使用的载体是本实验室运用的第三套 CRISPR-Cas9 系统，该系统针对水稻中已有的 CRISPR/Cas9 表达载体进行了改造，使用了棉花內源的 U6 启动子和合适的抗生素筛选标记。利用一个已经获得外源报告基因 DsRed2(红色荧光蛋白基因)的材料为受体进行二次转化，实现了两个靶标位点的同时敲除，再生植株的红色荧光完全消失。另外，以内源的棉花叶绿素合成相关基因 GhCLA1 为靶标设计的三对 sgRNA 也成功实现基因敲除，各靶标位点的编辑效率达到 66.7%到100%，再生植株产生显著的白化苗表型。对 T0 代植株及其后代的的遗传分析表明，目标基因可以被突变但没有脱靶效应，而且这种突变能够稳定遗传到后代。
此研究创新之处在于充分结合第二代高通量测序技术，实现对大量再生植株突变位点的快速鉴定，大大提高转基因植株突变鉴定的效率，为实现 CRISPR/Cas9 系统创造棉花基因突变体库及功能基因组研究打下坚实基础。
另外，《New Phytologist》杂志近日也在线发表了我校张献龙教授领衔的棉花团队和雷朝亮教授领衔的农业害虫团队合作研究的最新成果 《A transgenic strategy for controlling plant bugs (Adelphocoris suturalis) through expression of double-stranded RNA homologous to fatty acyl-coenzyme A reductase in cotton》，该研究通过 转基因棉花表达害虫靶标基因的dsRNAs实现了对中黑盲蝽有效防控。
在棉花生产过程中虫害一直是棉花产量降低的主要原因之一。近年来，在农作物种植结构改变、BT棉的广泛种植、广谱杀虫剂的使用量大大减少等因素的综合影响下，使棉花的非BT-靶标害虫——盲蝽蟓泛滥成灾，上升为主要害虫。目前在我国BT棉区中黑盲蝽为害十分猖獗，因此急需开发出新的盲蝽防治策略。植物介导的RNAi利用寄住植物表达靶基因的dsRNA，高量表达的dsRNA能够被植食性昆虫摄入体内，然后诱发昆虫体内相应基因的RNAi效应，进而成功干扰目标昆虫靶基因的表达，达到抑制害虫生长发育，甚至致死的目的。与目前可用的农药和BT毒蛋白相比，植物介导的rnai技术是一种更加安全、特异、高效的植物保护新策略。
经过大量的室内显微注射实验最终选择了影响中黑盲蝽卵巢发育的AsFAR基因作为最佳靶标，利用农杆菌介导的遗传转化得到了高量表达靶标基因dsRNA的转基因棉花。连续两年的室外抗虫鉴定表明，该转基因棉花对中黑盲蝽表现出较强的抵抗能力，降低了对棉花危害程度。该研究创造的转基因棉花不但为中黑盲蝽的防治提供的新的策略，而且还可以与BT棉杂交，为害虫多抗棉花的研究奠定基础。
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High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system
原文摘要：
Gossypium hirsutum is an allotetraploid with a complex genome. Most genes have multiple copies that belong to At and Dt subgenomes. Sequence similarity is also very high between gene homologs. To efficiently achieve site/gene-specific mutation is quite needed. Due to its high efficiency and robustness, the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 system has exerted broad site-specific genome editing from prokaryotes to eukaryotes. In this study, we utilized a CRISPR/Cas9 system to generate two sgRNAs in a single vector to conduct multiple sites genome editing in allotetraploid cotton. An exogenously transformed gene Discosoma red fluorescent protein2(DsRed2)and an endogenous gene GhCLA1were chosen as targets. The DsRed2 edited plants in T0 generation reverted its traits to wild type, with vanished red fluorescence the whole plants. Besides, the mutated phenotype and genotype were inherited to their T1 progenies. For the endogenous gene GhCLA1, 75% of regenerated plants exhibited albino phenotype with obvious nucleotides and DNA fragments deletion. The efficiency of gene editing at each target site is 66.7% to 100% .The mutation genotype were checked for both genes with Sanger sequencing. Barcode-based high-throughput sequencing, which could be highly efficient for genotyping to a population of mutants, was conducted inGhCLA1 edited T0 plants and it matched well with Sanger sequencing results. No off-target editing was detected at the potential off-target sites. These results proves that the CRISPR/Cas9 system is highly efficient and reliable for allotetraploid cotton genome editing.
作者：张献龙
