无细胞系统催化葡萄糖合成单萜

2017年5月24日，Nature Communications发表了来自美国加州大学洛杉矶分校题为：A synthetic biochemistry platform for cell free production of monoterpenes from glucose的研究。他们构建了一个包括27个酶的无细胞合成系统，不需要额外添加酶和辅因子可以连续稳定运行5天，该系统包含葡萄糖分解模块可以产生NAD（P）H和ATP，通过改变萜烯合酶将葡萄糖转化为不同的单萜，柠檬烯（12.5±0.3 g/L）和蒎烯（14.9±0.6 g/L）的滴度比工程细胞高近一个数量级，转化率大于95％，充分说明合成生化方法用于生物基化学品生产的潜力。

萜烯是一类工业上相关生物活性天然产物，被广泛用作香料，香料，生物燃料，商品化学品，维生素和药物，当前由植物提取获得。大肠杆菌和酿酒酵母都被成功地设计成生产单萜，但受到包括产品或中间体的毒性，竞争性内源途径，合成途径优化困难和昂贵的产品分离成本的制约。无细胞方法是在反应容器中简单地将粗酶或纯化酶混合在一起，可以部分规避工程细胞所面临的限制。

为确保产物合成的最大化和合成系统的持续性，以计算机模型CoPASI根据已知同工酶动力学参数对由葡萄糖合成柠檬烯的生化合成过程模拟，发现己糖激酶（Hex）和丙酮酸脱氢酶（Pdh）活性及初始Pi浓度是柠檬烯持续合成关键。在保证初始辅因子浓度其余酶水平不会限制反应条件下，对Hex，Pdh或Pi浓度的添加量进行优化。同时也证明由大肠杆菌NAD +依赖和来自嗜热脂肪芽孢杆菌的NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸酶及NADH氧化酶NoxE组成的分子清洗阀对柠檬烯高效合成是必需的，最终柠檬烯浓度达到2.57±0.15 g/L 。最后，为了确定体外系统的生物合成能力，添加500 mM葡萄糖，7天柠檬烯达到最终滴定量为12.5±0.3 g/L，达到理论产率的88.3％±4.6％。为测试合成生物化学系统生产其他单萜的通用性，通过更换单萜合酶产蒎烯和桧烯的终浓度分别达14.9±0.6 g/L和15.9 ±0.4 g/L，产率分别为103.9％±8.1％和94.5％±4.7％。说明合成生化方法用于生物基化学品生产的潜力。

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