The Plant Journal:中科院遗传所吕东平研究组发现细菌中实现植物泛
2017年5月16日，国际植物学权威期刊《The plant Journal》在线发表了中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心吕东平研究组的一篇研究论文，研究组利用合成生物学的手段，将编码以上5个植物蛋白的基因同时在同一大肠杆菌细胞中表达，获得了植物泛素化途径在细菌中的重建。研究组硕士研究生韩玉芳为论文第一作者，硕士毕业生孙建杭为共同第一作者。
泛素化是一种重要的真核生物蛋白质翻译后修饰方式，它决定了被修饰蛋白的命运。泛素化的过程分为三步系列的酶促反应，分别由E1、E2和E3来催化，并最终使泛素共价地结合到了底物蛋白上。通常来讲，整个泛素化途径至少需要五个蛋白的参与：泛素单体、E1、E2、E3和底物蛋白。
该系统具有以下优点：1)植物泛素化组分在细菌中表达后，直接参与了泛素化反应，因此免去了预先表达纯化这些蛋白质的步骤，这对于那些水溶性差的蛋白尤为重要;2)在该系统中，所有植物蛋白均在活细胞内进行泛素化反应;3)利用该系统可以产生大量的泛素修饰蛋白，这有利于下一步的泛素化位点鉴定和生化研究。因此，该系统提供了一种研究植物蛋白质泛素化的新方法。
图：植物泛素化在细菌中的重建，以ABI3及其对应的E3 泛素连接酶AIP2为例。a. 将编码ABI3(底物)，E1，AIP2(E3)，E2和Ub(泛素单体)的基因构建到三个带有不同选择性标记的且相容的原核表达载体中;b. 利用不同的相应标签抗体对这五个蛋白在泛素化中的状态进行检测
原文链接：
Reconstitution of the plant ubiquitination cascade in bacteria using a synthetic biology approach
原文摘要：
Ubiquitination modulates nearly all aspects of plant life. Here, we reconstituted theArabidopsis thaliana ubiquitination cascade in Escherichia coli using a synthetic biology approach. In this system, plant proteins are expressed and then immediately participate in ubiquitination reactions within E. coli cells. Additionally, the purification of the individual ubiquitination components prior to setting up the ubiquitination reactions is skipped. To establish the reconstituted system, we co-expressed Arabidopsis ubiquitin (Ub) and ubiquitination substrates with E1, E2 and E3 enzymes in E. coli using the Duet expression vectors. The functionality of the system was evaluated by examining the auto-ubiquitination of a RING (Really Interesting New Gene)-type E3 ligase AIP2 and the ubiquitination of its substrate ABI3. Our results demonstrated the fidelity and specificity of this system. In addition, we applied this system to assess a subset of Arabidopsis E2s in Ub chain formation using E2 conjugation assays. Affinity-tagged Ub allowed efficient purification of Ub conjugates in milligram quantity. Consistent with previous reports, distinct roles of various E2s in Ub chain assembly were also observed in this bacterial system. Therefore, this reconstituted system has multiple advantages, and it can be used to screen for targets of E3 ligases or to study plant ubiquitination in detail.
作者：吕东平
