PNAS: 高通量生化分析gRNA序列决定cas9（dcas9）脱靶效应

CRISPR-cas9系统已经广泛的应用于动物、植物、微生物的基因组编辑，关键是Cas9和DNA靶点的特异性结合，先前的文献已经研究了gRNA的区的突变对Cas9和DNA靶点结合特异性影响，但是上述研究都没有可直接通过生物物理参数的相互作用研究cas9的脱靶效应。来自Caribou Biosciences、及斯坦福大学、麻省理工大学及Caribou Biosciences的科研人员建立了一个高通量体外离题分析方法，揭示序列的特异性在何种程度影响Cas9和DNA靶点的特异性结合，相关成果近期发表在PNAS上。

图一

研究人员通过体外dCas9和gRNA突变体库及荧光标记DNA的结合，并将其体外锚定到细胞表面，经过不同时间的反应后通过流式细胞分析，研究dCas9和gRNA突变体库及荧光标记DNA复合体的结合及解离过程（图一）。通过相关分析，发现PAM区及-1到-7位碱基的单（双）碱基突变会造成初始的结合后由于目标区的不匹配而引起的排斥造成了脱靶效应，而PAM区远端的单碱基突变对脱靶效应影响较小；并且数据表明，具有高解离速率的脱靶突变有较低的结合速率，如果RDP的错配影响了R环的形成，将会影响dCas9绑定的稳定性，研究人员观察到多个PAM远端（-12到-17）的多个碱基的错配会触发比单个错配更快的解离。本研究结果揭示了组合DNA的复杂效应对dCas9的结合行为的扰动，并提供强大的工具进一步研究指导序列参数、靶序列、结合时间和蛋白质浓度之间的复杂关系。

图二

（发布：）

;