构建木糖、阿拉伯糖共利用酿酒酵母菌株

继E.boles首次成功构建基于异构化阿拉伯糖代谢途径的酿酒酵母之后，他们继续发力，在2006年又首次报道了可共利用木糖和阿拉伯糖菌株的构建过程，发表于Microbial
Cell Factories杂志。

在之前构建的可代谢阿拉伯糖酿酒酵母JBY25-4M基础上，研究人员试图引入真菌来源的木糖代谢途径，即导入整合型质粒YIpXR/XDH/XK，该质粒带有HIS营养缺陷型marker，XR和XDH基因来源于树干毕赤酵母。整合到宿主HIS3基因组位点。鉴于JBY25-4M菌株已经含有HIS
marker的YEparaA质粒。研究人员采用的策略是将JBY25-4M菌株中的4个阿拉伯糖代谢相关质粒先全部丢掉，包括araA/B/D和GAL2基因表达质粒。然后在HIS3位点整合木糖代谢途径，最后重新导入araA/B/D，放弃了GAL2，一方面marker不足，另一方面之前研究表明GAL2作用不是很大。最终获得菌株命名为BWY02.XA。

在含有50g/L阿拉伯糖的YNB培养基中好氧测试BWY02.XA菌株阿拉伯糖代谢能力，约100h之后OD达到6.5，对照菌株（不含阿拉伯糖代谢基因质粒）无生长。测试其单木糖代谢能力，在含有50g/L木糖的YNB培养基中好氧测试，比生长速率为0.013h-1，非常低。体外测定XR和XDH酶活分别为0.08U/mg
蛋白和1.36U/mg
蛋白，对照木糖菌株TMB3001为0.1和1.01。在50g/L阿拉伯糖和50g/L木糖混合培养基中测试发现该菌偏好利用阿拉伯糖，95h消耗35%阿拉伯糖和15%木糖。

鉴于实验室菌株不利于工业应用，同时BWY02.XA带有质粒，不能应用于实际生产。所以研究人员反其道而行之，在一株工业木糖酵母TMB3400上整合阿拉伯糖代谢途径。首先在TRP1基因座整合araB基因，获得菌株TMB3060。然后选取rDNA为整合靶点，进行araA和araD基因的多拷贝整合，在阿拉伯糖平板筛选转化子，选取一株生长较好转化子，命名为TMB3061。

测试TMB3061单阿拉伯糖表型，虽然比生长速率达到0.06h-1，不输BWY02.XA，但是最大OD只有3。测试在25g/L木糖和25g/L阿拉伯糖混糖培养基表型，TMB3061代谢木糖能力要强于阿拉伯糖，如图1所示。

图1 TMB3061混糖培养基表型

为进一步提升阿拉伯糖代谢能力，基于JBY25-4M菌株构建经验，该菌驯化后发现araA基因表达质粒拷贝数上升。研究人员又重新进行了araA基因的转化，在阿拉伯糖液体培养基传代3次，最后平板筛选生长优势转化子，命名为TMB3063，该菌比生长速率虽略有下降为0.04h-1，但最终OD可达到6。测试TMB3400、TMB3061和TMB3063木糖表型，发现比生长速率分别为0.08
h-1，0.03 h-1和0.012
h-1。测试XR和XDH酶活发现同TMB3400相比相差不大甚至略有提升，说明木糖表型下降不是酶活降低造成。

最后研究人员测定了获得的系列菌株厌氧分批发酵表型。BWY02.XA在20g/L葡萄糖+20g/L阿拉伯糖培养基中，葡萄糖在约25h消耗完，之后到120h，消耗20%阿拉伯糖，速率为0.03g
arabinose/h g cell，无乙醇生成。在20g/L葡萄糖+20g/L木糖培养基中，葡萄糖在约25h消耗完，之后到120h木糖基本吃完，速率为0.1g
xylose/h g
cell，乙醇转化率为0.23。在20g/L葡萄糖+20g/L阿拉伯糖+20g/L木糖培养基，BWY02.XA代谢木糖和阿拉伯糖速率相同，大约为0.04g /h
g cell，120h内接近一半的木糖和阿拉伯糖被消耗，木糖醇转化率为0.33g xylitol/g xylose，而阿拉伯糖醇转化率高达1g
arabitol/ g arabitol。

TMB3400在0g/L葡萄糖+20g/L阿拉伯糖+20g/L木糖培养基中，120h木糖吃完，阿拉伯糖吃3g/L，木糖消耗速率为0.066 g
xylose/h g cell，阿拉伯糖消耗速率为0.01 g arabinose/h g
cell。TMB3063吃木糖少一点，为16g/L，吃阿拉伯糖达到11g/L。代谢速率分别为0.042 g xylose/h g cell和0.029 g
arabinose/h g cell，产乙醇也是最多。

总结一下，好氧条件，混合木糖和阿拉伯糖培养基，BWY02.XA阿拉伯糖利用能力占优而TMB3061木糖占优，作者推测可能是途径基因在各自菌株拷贝数不同所致。厌氧条件，混合培养基，BWY02.XA反倒木糖占优，阿拉伯糖都转化为阿拉伯糖醇，作者推测是XR基因所致。同时木糖代谢能力相较单木糖培养基下降，作者认为是两种戊糖存在竞争，也有可能PPP途径活力还不够，转运能力不够等。对于TMB3400而言，引入阿拉伯糖代谢途径后木糖代谢能力下降，这种下降不是XR和XDH酶活的下降，作者认为是导入阿拉伯糖途径后菌株的代谢负担。

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