甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的克隆及原核表达载体的构建

根据已知的甜瓜蛋白激酶类基因CmPKC的部分序列，设计带有酶切位点的引物，采用RT-PCR方法获得该基因的完整cDNA序列，并对其蛋白进行功能预测和理化性质分析；采用实时荧光定量PCR分析不同白粉病抗性材料、不同处理时间点该基因的表达量变化情况；将该基因完整的ORF连接到原核表达载体pEASY-E1上，转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)，通过不同浓度IPTG诱导表达，获得适宜的诱导表达体系，SDS-PAGE检测表达产物。结果表明克隆获得的CmPKC基因长约为2 830 bp，开放阅读框为2 493 bp，编码831个氨基酸。生物信息学预测该蛋白的跨膜区域有4个信号肽；在甜瓜白粉病不同抗性材料上相对表达量变化趋势不同，在抗性材料上表达丰度出现的时间较感病材料早，且在不同材料上相对表达量变化趋势与已报道的一个甜瓜感病相关MLO家族基因一致，推测我们所获得的基因也可能与感病及开花、生长发育基因相关，且属于早期应答基因。该蛋白适宜的诱导体系是100 mg/mL IPTG诱导4小时，原核表达产物与预期大小一致，表明该基因能够成功表达，为深入探索该基因的功能提供了研究依据。