酿酒酵母首次成功利用阿拉伯糖产乙醇

继2001年普渡大学Nancy W.Y. Ho课题组首次将大肠杆菌来源的araBAD基因在酿酒酵母体内成功异源表达之后，基于细菌来源的异构化途径，2003年E.Boles首次成功实现了酿酒酵母代谢阿拉伯糖产乙醇。

2001年普渡大学Nancy W.Y. Ho的研究一个很重要的结论是大肠杆菌来源的阿拉伯糖异构酶在酿酒酵母体内活性很低，E.Boles的研究也证实了这一点。他们首先克隆了大肠杆菌来源的araA基因在酿酒酵母表达，发现没有任何阿拉伯糖异构酶的活力。替换为枯草芽孢杆菌和耻垢分枝杆菌来源的araA之后发现可检测到阿拉伯糖异构酶活力。以实验室常用酵母CEN.PK2-1C（JBY24）为宿主，将3个途径基因araA（枯草芽孢杆菌来源）、araB（大肠杆菌来源）、araD（大肠杆菌来源）和一个transporter基因GAL2（酿酒酵母内源）分别克隆到高拷贝载体，置于强启动子后表达，获得的酿酒酵母转化子（JBY24-4P）无法在阿拉伯糖培养基生长。

研究人员采用驯化手段，即将目的转化子在单阿拉伯糖液体培养基中连续传代，发现4-5天之后菌浓明显上升，然后进入传代，每次传代出发菌浓是0.3。总时间达到约750h时，菌浓OD600可达到10，倍增时间为8.5h，相比于初始菌株表型大幅提升。为了排除表型进步不是对环境的适应而是自发突变造成，研究人员又在单葡萄糖碳源培养基中传7代，随后转接入单阿拉伯糖培养基，发现菌株表型不变，说明表型进步非适应性。

图1 驯化提升菌株利用阿拉伯糖生长能力

为了解析表型变好机制，研究人员首先测定了驯化菌株阿拉伯糖代谢途径的酶活，发现araA和araD表达酶活在驯化前后菌株没有变化，测序表明序列也没有发生变化。而araB基因表达酶活在驯化后菌株几乎检测不到，测序发现361位发生G到A的碱基突变。为了验证araB酶活下降对菌株表型的贡献，研究人员将驯化后菌株中的araB替换为野生型，发现菌株在阿拉伯糖培养基上的生长严重受损，野生型araB放到单拷贝质粒上，表型有所提升。但是将驯化后菌株中突变的araB置于单拷贝质粒上，菌株表型并没有再次提升，说明araB酶活下降对于菌株表型有所贡献但是又不能下降的太厉害。

接下来研究人员分析了途径基因araA/B/D和转运体基因GAL2对菌株利用阿拉伯糖的必要性，发现途径基因是必要的，缺一不可，而去掉GAL2后菌株利用阿拉伯糖能力轻微下降，说明该基因非必须。

将驯化后菌株中的araA/B/D和GAL2表达质粒提取出来，导入出发菌株，结果表型未见提升。说明菌株基因组上存在有利突变，鉴于此，研究人员构建了驯化后菌株的基因组文库，导入含有araA/B/D基因的酵母菌株，在单阿拉伯糖平板筛选，抽提长出转化子的质粒，发现均含有TAL1基因。利用芯片对全基因组转录水平分析，发现包括TAL1在内的12号染色体右臂包含基因发生显著转录上调，推测该区域发生了染色体扩增。在含有araA/B/D 3基因的出发菌株中导入TAL1表达质粒，发现菌株性能大幅提升，暗示TAL1对表型贡献。最后研究人员进行了阿拉伯糖产乙醇发酵。

图2 菌株利用葡萄糖、阿拉伯糖产乙醇

根据该项研究，酵母若想利用阿拉伯糖产乙醇，研究人员认为重点在以下几个方面，一是araA酶活的保证。一定的araA酶活是菌株表型的必要条件。二是适当的araB酶活，不能太高，可能和ATP消耗有关。三是酵母内源TAL1活力的提升。最后转运体GAL2对表型有贡献，但非必需。

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