蓝细菌通过CRISPR干扰（CRISPRi）调控琥珀酸生产

蓝细菌PCC
7942具有生化转化的能力，但是如果通过PCC 7942的基因敲除来达到生化转化的目的会非常耗时，并且可能导致细胞死亡。CRISPR干扰（CRISPRi）作为一种新兴技术，利用无切割活性的Cas9（dCas9）和靶向gRNA（sgRNA）来调控特定基因的表达，而无需基因敲除。

使用CRISPRi来处理PCC
7942中的基因网络，将靶向不同区域的黄色荧光蛋白（EYFP），dCas9和sgRNA整合到PCC 7942染色体上（图1）。dCas9和sgRNA的共表达抑制EYFP产生的效率超过99％，而且不会损害细胞生长。接下来将dCas9和sgRNA整合到糖原积累必需的内源基因（glgc）上和琥珀酸转化为富马酸所必需的内源基因（sdhA和sdhB）上。根据sgRNA结合位点，glgc，sdhA和sdhB的转录水平被有效地抑制。最终，glgc的靶向抑制将表达降低至6.2％，糖原积累减少至4.8％，显著提高了琥珀酸滴度。靶向sdhA或sdhB也有效地抑制了基因表达，并将琥珀酸滴度提高约12.5倍，已经达到了0.58-0.63mg/
L。

这些数据表明，CRISPRi介导的基因抑制允许重新导向细胞碳流，从而为PCC
7942的代谢途径的微调开拓了新途径。

文章成功利用了CRISPRi技术对蓝细菌PCC 7942相关基因表达进行了调控。通过合适的sgRNA设计，能够选择性地降低外源性报道基因（EYFP）和内源基因（glgc，sdhA和
sdhB）表达，有目标的抑制参与琥珀酸合成的内源性基因的表达，从而增加了琥珀酸产量，而且，产物滴度与基因抑制程度呈正相关。

图1 在PCC
7942中构建的CRISPR体系

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