单分子测序技术组装出高GC含量的极地微生物基因组
基因有限公司,2012/08/29
导读:韩国极地研究所的 Park博士在极地微生物研究中为了揭示Streptomyces菌株的基因组信息（7.6Mb），利用单分子测序的PacBio RS平台对该基因组进行验证，获得平均1.5kb的长片段进行基因组组装，从而首次得到该细菌的完整基因组信息。
极地微生物是一个特殊的群体，它们生存在正常生物无法生存的环境中，对这些微生物进行研究能够揭示诸如全球气候变暖、生物进化等方面的问题。此外，这些极地微生物有着迥异于正常环境微生物群体的代谢类型，能够帮助人们寻找更加有效的抗生素，有助于发现新型的药物应用于医学领域。
如果需要进行上述研究，最好的方法是对极地微生物进行de novo测序，从根本上揭示它们的生物学信息。然而，这些极地微生物的基因组类型也有别于其他环境微生物群体，比如说极地微生物基因组中的GC含量极高（>75%），这种“极端”基因组给测序和信息解读造成了非常大的困难。
韩国极地研究所的 Park博士一直致力于极地微生物研究，为了揭示从南极乔治王子岛分离得到的Streptomyces菌株的基因组信息（7.6Mb），Park博士的研究团队首先利用illumina Hiseq 2000平台对其基因组进行测序。Streptomyces 的基因组中GC含量高达71%，即使利用Hiseq2000平台进行了200×深度的测序，仍无法获得完整的基因组，组装时产生了185 个contigs，随后使用Sanger法仍然无法有效的填补gap。
单分子测序技术在高GC含量基因组的应用
Park博士表示，用其他的短序列测序技术仍然“不可能”填补这种高GC含量的基因组gap，所以他们转而利用PacBio RS平台对该基因组进行验证。由于PacBio RS测序技术具有单分子分辨率，不引入PCR过程，没有GC偏向性，研究人员利用该技术获得了高准确度的CCS数据和平均1.5kb的长片段进行基因组组装，仅仅对基因组覆盖15×就能组装得到26个contig（减少了86%），大大降低了基因组组装的难度，而且gap也大为减小，使得他们首次获得了该细菌的完整基因组信息。
Park博士和他的团队认为PacBio的单分子实时测序技术“对高GC含量的基因组有着更好的测序能力，并且也是一项非常好的改善de novo测序和组装的新工具”
Park博士受到该技术的鼓舞，决定继续利用PacBio技术破解其他极地微生物基因组的组装难题，挑战此前“不可能完成的任务”。
延伸阅读：单分子测序升级参考基因组
现代基因组学的最大需求之一，就是得到人类和模式生物的高质量完成基因组。目前，人们利用二代测序技术对越来越多的物种（从原核生物到真核生物）进行了基因组测序，取得了许多重要的研究成果。
不过大部分物种的基因组还中存在有大量的缺口gap，就目前的数据来说，各种已测序物种的基因组中缺口gap所占的百分比从1.3%至13%不等。这是由于二代测序技术生成的片段短，而过短的测序片段无法跨越高度重复和高GC含量的基因组区域。大量的基因组空白区域中可能存在有重要的生物学功能信息，如果无法补齐这些缺口，不仅不能获得完整的基因组物理结构图，还会给基因组信息的解读造成不小的困难。目前人们主要使用步进PCR结合Sanger测序或者illumina/454 Pair-end测序数据来填充空白区域，但是这些方法费时费力，成本高，填充效率低，无法从根本上解决问题。
美国Baylor医学院的Richard Gibbs团队正在进行一项重要研究，利用单分子测序技术对模式生物的基因组草图进行升级。他们借助的正是Pacbio RS单分子测序的独特之处，这一技术无需PCR过程，能够轻松完成高GC含量片段和高度重复区域片段测序。该研究团队的目标是准确、自动化、快速且可重复的进行基因组升级，他们还专门开发了高度自动化的工具PBJelly，能够将Pacbio测序得到的长片段与基因组草图进行比对，填补或减少草图中的缺口，从而完善基因组草图。
Richard Gibbs的团队利用PacBio的长读长，对两个果蝇种（Drosophila pseudoobscura和Drosophila melanogaster，基因组缺口6.7M，占基因组大小5%）、虎皮鹦鹉（M. undulates，基因组缺口155M,占基因组大小11%）、黑子白眉猴（C.atys，基因组缺口198M，占基因组大小7%）的基因组进行了升级。他们首先利用PacBio单分子测序技术进行覆盖（深度从4.4×到24×不等），然后使用PBJelly流程进行分析。研究显示长读长数据可以大大降低基因组中的缺口数，其中D. melanogaster的基因组缺口数减少了15倍，虎皮鹦鹉和白眉猴的基因组缺口数减少了1.3至2.8倍，且这些基因组的缺口大小也减少了3-6倍。随后，研究人员对随机选择的96个缺口进行了Sanger测序，验证了这一方法的可靠性。
在这一研究中，单分子测序技术帮助研究者们获得了很好的结果，大大提高了基因组的完整性，也降低了后续实验和分析的难度，远远优于传统方法。
研究人员对于含有大基因组的脊椎动物（虎皮鹦鹉基因组大小1.2G、黑子白眉猴2.8G)只进行了低深度的测序（4.4-6.8×）就能较好的改善其基因组完整性，说明PacBio测序技术在大型基因组组装领域具有强大的功能和应用潜力。
该项目还在继续进行中，研究人员将会不断的改进组装方法，提高基因组缺口的填补效率。目前，他们正在用这一方法对灵长类动物的基因组进行升级。
