J Biotec:中科院遗传所陈良标研究组发明简单高效全长cDNA文库构建

国际期刊《JouRNAl of Biotechnology》在线发表了中国科学院遗传发育所陈良标研究组的一篇研究论文，研究发现了一简单、有效的cDNA全长文库构建方法，论文题为“Trehalose as a good candidate for enriching full-length cDNAs in cDNA library construction”。陈雷为论文第一作者，陈良标研究员为论文通讯作者。

cdna文库是研究生物活动的一种极为有效的工具。然而，能否获得全长cDNA文库成为制约这一研究的关键。cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板, 逆转录形成的互补DNA(cDNA)后与载体连接形成的包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合。cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。而能否获得全长编码信息的cDNA文库就成为了研究这一特定组织或细胞在特定生物阶段活动信息的关键。

然而，当mRNA具有复杂二级机构或高GC含量时，逆转录通常会提前终止，使逆转录酶从RNA模板解离，或者跳过这一具有发杂二级结构区域。而高温无疑是破坏这种复杂二级结构，使逆转录顺利进行下去的有效手段。高温在破坏复杂二级结构的同时同样具有降低逆转录酶活性的特性。因此，如何在保证逆转录酶活性的同时破坏复杂二级结构就成为了解决问题的关键。遗传发育所陈雷及其同事以一种简单、有效的方法解决了这一问题。他们以海藻糖具有稳定酶活性为基础，利用添加0.6 摩尔浓度的海藻糖到逆转录反应里，通过梯度升高反应温度，即42℃反应60分钟，然后在50℃、55℃以及60℃分别延长反应20分钟，使全长cDNA在文库中的含量从12%提高到32%，而平均cDNA长度也从1.0kb提高到1.8kb。与传统的cDNA文库构建方法相比，该研究极大程度的提高了cDNA文库的质量和成功率。同时，该研究所具有简单、高效且实用的特点被韩国生物公司(Bioneer Corporation)所借鉴并成功申请专利(WO2008115002 A1, US8058007 B2)。

原文链接：

Trehalose as a good candidate for enriching full-length cDNAs in cDNA library construction

原文摘要：

It has been reported that the disaccharide trehalose is capable of increasing the thermostability and thermoactivity of reverse transcriptase, and therefore improving the length of cDNA synthesis. However, no test has been done on how the disaccharidetrehalose performs in the context of the entire cDNA synthesis processes, or whether it can seamlessly integrate into the commercially available cDNA synthesis kit. In this report, we optimized a protocol to incorporate trehalose in the Stratagene’s cDNA library construction kit in order to demonstrate great improvement in cDNA’s length (average length of 1.8 kb in the trehalose group versus 1.0 kb in the control). Sequence analysis of the cDNA clones showed that the addition of trehalose did not increase the error rate of the RT products but greatly increase the quantity of full-length in cDNA library.

DOI:10.1016/j.jbiotec.2006.07.033

作者：陈雷