张锋 Cell 发表综述：一文详解第二类 CRISPR-Cas 系统

80 后华人学者张锋（Feng Zhang）近年来频频获奖，出现在各大媒体杂志中，这是因为他作为基因组编辑技术 CRISPR 的开创者之一，在将 CRISPR/Cas 应用到人类细胞中起到了关键的作用。去年美国麻省理工学院 MIT 宣布了五位最新晋升终身教授的副教授，张锋就位列其中，据报道在 MIT 历史上，钱学森在 35 岁时晋升为终身教授，并曾在很长一段时间里是麻省理工学院最年轻华人终身教授纪录的保持者，而去年年仅 34 岁的张锋教授刷新了这一记录。

此外今年张锋还成为了第一位 MIT 的 James and Patricia Poitras 教授，他对此表示，“我非常荣幸地被任命为神经科学的第一任 James 和 Patricia Poitras 教授。Poitras 家族和我都热爱着针对主要精神疾病的研究，治疗与最终实现治愈。这个头衔是对我们研究组在基因组及分子工具研究精神疾病方面的的一个重要认可。”

近期张锋教授也与另外两位学者在 Cell 杂志上发表了题为 “SnapShot: Class 2 CRISPR-Cas Systems” 的特写文章，介绍了新一代 CRISPR 基因组编辑系统：Class 2 CRISPR-Cas Systems。

2015 年，张锋及其同事们就报告称发现了一种不同的 CRISPR 系统，具有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。这个新系统是通过在不同类型的细菌中搜寻了成百上千种的 CRISPR 系统，寻找具有有用特性的酶，结果来自氨基酸球菌属（Acidaminococcus）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的 Cpf1 酶成为新的候选物。

这一新发现的 Cpf1 系统有几个重要的方面不同于以往描述的 Cas9，Cpf1 系统更简单一些，它只需要一条 RNA。Cpf1 酶也比标准 SpCas9 要小，使得它更易于传送至细胞和组织内；Cpf1 以一种不同于 Cas9 的方式切割 DNA。当 Cas9 复合物切割 DNA 时，它切割的是同一位点的两条链，留下的 “平端”（blunt ends）在重新连接时往往会发生突变。采用 Cpf1 复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（overhang）。这预计有助于精确插入，使得研究人员能够更有效及精确地整合一段 DNA；Cpf1 切口远离识别位点，这意味着即便在切割位点靶基因突变，仍然可以进行再度切割，提供了多次机会来校正编辑；Cpf1 系统为选择靶位点提供了新的灵活性。像 Cas9 一样，Cpf1 复合物必须首选附着 PAM, 短序列，选择的靶点靠近自然存在的 PAM 序列。Cpf1 系统识别的 PAM 序列与 Cas9 截然不同。这在靶向某些基因组如疟原虫及人类基因组时可能是个优势。

文章指出，第二类 CRISPR-Cas 系统基于不同的效应蛋白家族，可以分为 3 种类型和 9 种亚型，其中譬如 Cas9 和 Cas12a（Cpf1）已成功地用于基因组工程。在此前的研究中，张锋研究组也采用了一种新生物信息学方法来发现暂时被命名为 C2c1、C2c2 和 C2c3 的新蛋白，他们开发出一系列的计算方法来搜索 NIH 基因组数据库，鉴别新的 CRISPR-Cas 系统。

除此之外，张锋研究组也提出了一些新的尝试，如他们构建出了 32 个具有单个点突变的 Cas9 突变体，借助于已验证易错配的向导 RNA 将它们靶向 EMX1 基因。张锋将这些特异性增强型 Cas9 蛋白称作为 “eSpCas9 变体”。测试大量的向导 RNAs 与具单个点突变的 eSpCas9 和具三个点突变的 eSpCas9，他们发现两种 eSpCas9 能够以相似的效率编辑靶位点。

张锋课题组还开发了一些基于功能获得性 CRISPR 的筛查方法。利用这一基于 CRISPR 的新工具来激活 SAM 基因，他的研究小组证实这一工具可以激活采用旧方法难于开启的 12 种不同的基因。“有许多基因采用旧系统无法激活，这一新系统能够激活转录达 100 倍或 1000 倍，” 张锋说。

去年年底，张锋研究组发现 Cpf1 能够加工自己的 CRISPR RNA (crRNA)。而且 Cpf1 介导的 pre-crRNA 加工是独立于 DNA 剪切的。这种能力可以用来简化多重基因组编辑。他们在此基础上设计 CRISPR 阵列，用一个载体同时在哺乳动物细胞编辑了四个基因，在小鼠大脑编辑了三个基因。这是在 CRISPR–Cpf1 的基础上打造了一个多重化基因编辑系统。