ACS Synth Biol:中科院微生物所温廷益研究组等开发基于毒素-抗毒素

2017年1月17日，国际合成生物学领域知名期刊美国化学联合会合成生物学杂志《ACS synthetic biology》在线发表了中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室温廷益研究组和军事医学科学院毒物药物研究所车永胜研究组合作的一篇研究论文，研发了基于毒素-抗毒素系统的基因编辑新技术。微生物所博士生吴杰与邓爱华副研究员为该文的第一作者，温廷益研究员与车永胜研究员为通讯作者。

高效的基因编辑技术是基础生物学和生物技术研究的核心技术，在生命科学和生物医学等领域扮演着日益重要的角色。基于细菌和古菌防御系统建立的高效遗传操作技术是基因组编辑领域的研究热点，如利用限制性修饰(RM)系统建立的DNA甲基化模拟系统(MoDMP)和利用规律成簇的间隔短回文重复序列建立的CRISPR技术。最近发现，毒素-抗毒素系统(Toxin-Antitoxin system)通过利用位于同一操纵子上的毒素和抗毒素基因的编码产物调节细胞的生长与死亡/休眠，使其适应各种胁迫条件，是原核细胞中普遍存在的一种防御系统。这种能特异调节细胞生长与死亡的机制能够被应用于细菌DNA克隆、蛋白表达和遗传操作中。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)作为一种革兰氏阳性细菌的模式菌，其遗传操作系统在各种生理代谢、信号调控以及系统代谢工程等研究中起着重要作用。尽管在芽胞杆菌中已建立了位点特异重组酶介导方法、反筛方法以及CRISPR-Cas9等基因编辑技术，但是革兰氏阳性细菌的细胞壁结构复杂、细胞抵抗毒性能力强等特点导致遗传操作的假阳性率高。因而，现有的遗传操作方法无法高效稳定地对芽胞杆菌等大多数的革兰氏阳性细菌进行基因编辑。

针对革兰氏阳性细菌缺乏高效、稳定的无痕遗传操作系统的这一瓶颈问题，研究人员将细菌毒素—抗毒素系统重编程为由抗毒素开关调控的毒素反筛模块(Toxin Counter-selectable Cassette Regulated by an Antitoxin Switch, TCCRAS)，并经过优化使其适用于枯草芽胞杆菌和谷氨酸棒状杆菌等革兰氏阳性细菌的基因编辑。首先，利用组成型与诱导型启动子分别启动毒素与抗毒素基因表达的策略，构建了抗毒素开关调控的毒素反筛模块(TCCRAS);通过筛选五种不同来源的II型TA系统获得了一个高效的反筛模块relBE，并构建了携带TCCRAS系统的遗传操作载体。利用该系统可以在枯草芽胞杆菌中高效实现了功能基因的缺失、插入、替换、精确点突变与大片段DNA的插入与删除(最高达194.9kb)，并通过插入Pspac-crtI-crtE-crtB操纵子，首次在枯草芽胞杆菌中实现了番茄红素的生物合成。此外，可以利用该系统进行谷氨酸棒杆菌染色体基因的无痕敲除、替换及高达179.8kb片段的删除，反筛与突变效率分别为100%与17.9-85.9%，明显高于传统的SacB系统。利用该方法成功地构建了直接发酵法产戊二胺的谷氨酸棒杆菌工程菌，为今后利用谷氨酸棒杆菌生产戊二胺奠定了基础。

本研究通过构建抗毒素开关调控的毒素反筛模块，成功建立了一种新型的基因编辑技术，在革兰氏阳性细菌中实现了染色体基因的无痕敲除、敲入、替换、点突变及大片段删除和插入。TCCRAS方法具有不引入任何标记、遗传稳定、效率高、用途广等优点，其可作为一种有效的遗传操作工具用于系统生物学及合成生物学研究;同时，该方法还能够在基因组水平高效地实现对多种革兰氏阳性细菌的代谢工程改造，为人工设计构建高效的细胞工厂和新型的生物催化剂，实现重要化合物的生物合成提供技术平台，提升微生物在医药、农业、工业等多个领域中的应用价值。

原文链接：

Bacterial Genome Editing via a Designed Toxin–antitoxin Cassette

原文摘要：

Manipulating the bacterial genomes in an efficient manner is essential to biological and biotechnological research. Here, we reprogrammed the bacterial TA systems as the toxin counter-selectable cassette regulated by an antitoxin switch (TCCRAS) for genetic modifications in the extensively studied and utilized Gram-positive bacteria, B. subtilis and Corynebacterium glutamicum. In the five characterized type II TA systems, the RelBE complex can specifically and efficiently regulate cell growth and death by the conditionally controlled antitoxin RelB switch, thereby serving as a novel counter-selectable cassette to establish the TCCRAS system. Using a single vector, such a system has been employed to perform in-frame deletion, functional knock-in, gene replacement, precise point mutation, large-scale insertion, and especially, deletion of the fragments up to 194.9 kb in B. subtilis. In addition, the biosynthesis of lycopene was first achieved in B. subtilis using TCCRAS to integrate a 5.4-kb fusion cluster (Pspac–crtI–crtE–crtB). The system was further adapted for gene knockdown and replacement, and large-scale deletion of the fragments up to 179.8 kb in C. glutamicum, with the mutation efficiencies increased by 0.8–1.0-fold compared to the conventional SacB method. TCCRAS thus holds promise as an effective and versatile genome-scale engineering technology for metabolic engineering and synthetic genomics research in a broad range of the Gram-positive bacteria.

DOI: 10.1021/acssynbio.6b00287

作者：温廷益和车永胜