中国农大开发 CRISPR 工具，促进植物多重基因编辑
在植物中产生多个基因的有效突变仍然是一个挑战。2 月 3 日，来自中国农业大学的陈其军教授在《 Scientific Reports 》发表的一项研究中，开发了一种新的用于植物 CRISPR / Cas 系统合成的生物学工具箱 MISSA 2.0 。可以有效的促进两个或多个正交 CRISPR / Cas9 系统的植物多重基因组编辑。
使用 CRISPR / Cas 系统诱导多重突变需要构建多个 sgRNA（单指导 RNA）。由于多个 sgRNAs 的高效装配方法，使得两种或更多种 sgRNA 的高效表达已不是问题。因此，在理想的情况下，CRISPR / Cas9 可以同时编辑无限数量的基因组位点。
然而，目前的情况是远非理想的：有效的基因编辑需要在核中维持 sgRNA-Cas9 复合物每个突变的适当浓度。而 sgRNA-Cas9 复合物突变的功能性浓度与 sgRNA 或靶位点的数量成反比。多个 sgRNA 在细胞中的表达会影响 sgRNA-Cas9 复合物突变的浓度，从而降多重基因组编辑的效率。因此，在植物中产生多个基因的有效突变仍然是一个挑战。
为了克服这一障碍，陈其军研究组建立了 MISSA 2.0，第二代 MISSA 技术的发展，具有改进的、经验证的一站式 MISSA 试剂，可用于有效装配两个或更多个正交 CRISPR / Cas 系统。
MISSA 是一种可回收的、体内位点特异性 DNA 装配方法。在 MISSA 2.0 中，研究人员的一个关键性改进是他们开发了一种基于质粒 RK2 的新型自杀供体载体系统，其具有更高的克隆能力（> 300kb）。新的自杀供体载体系统可以更好地满足用高分子量 DNA 装配的要求，例如 CRISPR / Cas 系统。
研究人员首先将多个 DNA 片段装配到大肠杆菌染色体中，并通过产生组成型或诱导型过表达多个基因的拟南芥转基因植株来验证 MISSA 2.0 这一新工具的效用。随后发现基于 RK2 的 MISSA 2.0 供体载体的更高克隆能力能显著促进两个正交 CRISPR / Cas 系统（包括 SpCas9 和 SaCas9）的装配，从而促进了携带两个正交 CRISPR / Cas9 系统的转基因品系的产生。
MISSA 2.0 这一工具将有助于基于两个或多个正交 CRISPR / Cas9 系统的植物多重基因组编辑的发展，并且还可以实现植物合成生物学的进步。
本文通讯作者是中国农业大学植物生理学与生物化学国家重点实验室的陈其军教授。他的研究方向为建立并应用植物合成生物学技术及基因组编辑技术提高植物抗逆性和营养高效性。在植物基因组编辑领域，采用卵细胞特异性启动子驱动 Cas9 策略，有效克服了拟南芥突变体嵌合问题，为拟南芥功能基因组研究提供了有应用价值的手段，并建立了有效的 CRISPR/Cas9 植物基因组编辑工具箱。
参考文献：
Hai-Yan Zhang, Xing-Hui Wang,, Xue-Chen Wang & Qi-Jun Chen.MISSA 2.0: an updated synthetic biology toolbox for assembly of orthogonal CRISPR/Cas systems.Scientific Reports (2017) doi:10.1038/srep41993
本文来源于：生物360
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