《Nature Methods》：显微新技术瞄准活细胞“小世界”

?SDOM的原理示意图

10月31日，Nature Methods杂志的“研究亮点”栏目报道了由北京大学席鹏课题组及其合作者提出的一种新的基于偏振偶极子方位角的超分辨技术SDOM。这一技术不仅为超分辨提供了一种全新的荧光偶极子的维度、提升了分辨率，能够更清晰地认识其标记的蛋白结构，还为本领域近期的一个热点争论提供了解答。

北京大学博士生张昊、清华大学博士生陈龙为共同第一作者，北京大学席鹏教授、澳大利亚悉尼技术大学金大勇教授及清华大学清华信息国家实验室张奇伟课题组的高军涛副研究员为共同通讯作者。

从“显微”到“显纳”

随着显微技术的发展，人们观察事物的尺度已经可以深入到微米，甚至是纳米级别。

然而，显微技术本身也有天花板。德国物理学家恩斯特·阿贝曾指出：光学显微镜分辨率的极限，大约是可见光波长的一半，最小约为200纳米(阿贝衍射极限)。

不仅如此，显微技术本身的发展局限也会影响到其它学科。北京大学工学院教授席鹏告诉《知识分子》，比如，生物学家更乐于追求在微观层面了解生命的奥秘，“分辨率决定了细胞的研究深度”。

据席鹏介绍，显微镜主要分为光学显微镜和电子显微镜两大类。电子显微镜虽然分辨率可以做到很高，但低温、真空等实验环境往往会影响实验对象的生物活性。因此，科学家们一直在不断努力，试图寻找突破光学显微镜分辨极限的方法。

在寻求突破的过程中，诺奖得主Eric Betzig于1995年在论文中提出了“从不同维度将荧光分子区分开来，从而实现超分辨”的想法论。这一思想与现实中三维空间观察(超分辨)及对应二维投影(传统成像)类似。

在进行显微观察时，人们为了确定单点的位置，会从不同维度对一个点进行描述，最简单的方法就是坐标法：在三维空间确定三个坐标轴，然后用三个维度(x,y,z)进行描述。而Betzig教授则添加了第四个维度——时间，将空间上重叠的点分离，从而更加细致的描述一个点的位置。随后，Betzig教授提出了单分子定位超分辨技术PALM，这一技术通过在时间维度将分子分开，从而实现了超分辨。

然而，虽然PALM的空间分辨率可达10-20纳米，却由于该技术需要将粒子在时间上拆分，直接造成时间维度的牺牲，因此其成像时间比较长(典型在十几分钟量级)。

?Betzig提出的超分辨思想：从另一维度对荧光分子进行分离，从而达到超分辨。

偏振：超分辨显微的新“四维”

此次席鹏课题组则在三维坐标的基础上引入了第四个新的维度——荧光偏振。

荧光的偏振特性(Fluorescence Polarization)的发现要早于超分辨概念，1926年就被Jean Baptiste Perrin(法国物理学家，1926年诺贝尔奖获得者)等人发现。然而在荧光超分辨显微中，对于荧光的其他特性如荧光强度、激发与吸收光谱、荧光寿命等方面，皆存在很好的应用，但人们却对荧光偶极子的方向(偏振)却甚少关注。

虽然之前有科学家在偏振方向做出了一定的尝试，但所获成果却在该领域引起了一定的争议和质疑。

2014年，Peter J. Walla课题组在Nature Methods上发表文章，通过对激光进行偏振调制来实现稀疏重构的超分辨成像。而在今年年初，同样在Nature Methods上，Jan Keller课题组则对此提出了质疑，并发表了针对这一文章的评论：利用荧光偏振不能够获得进一步的超分辨。Walla课题组一方面承认了Keller等人的观察，另一方面则用新的实验捍卫他们自己的工作，从而引出了一个有意思的争论：偏振调制能否为超分辨带来更多信息?

由于Walla课题组和Keller课题组都是从传统的荧光强度来看待这一问题，席鹏课题组及其合作者则从偏振方向提出了一种名为SDOM(Super-resolution Dipole Orientation Mapping)的新型超分辨技术，该技术引入荧光的偶极子角度作为荧光分子的第四维度，同时从荧光强度和荧光各向异性来考虑偏振调制能否带来更多超分辨信息，完美地回答了这一争论[7] 。

?Nature Methods 2016年1月就“偏振调制是否对超分辨有帮助”这一问题展开了争论。

据席鹏介绍，传统的荧光各向异性显微成像技术往往只能观察简单样本的荧光偏振，而对于复杂样本，荧光的偏振由于阿贝衍射极限的存在会受到众多荧光团的影响，从而只能观察到平均效果。而超分辨偶极子方向映射(SDOM)技术则实现了同时观察荧光的强度和偏振，从偏振调制数据中将空间强度信息和偏振信息解调出来，既提升了成像的空间分辨率，也提升了探测荧光团偶极子方向的精度。

“一方面，我们通过在传统荧光显微镜的外部加上一个偏振片，使入射的激发光产生偏振;另一方面，我们联合合作者编制相应的算法对被观察物体的偏振进行分析解调，从而获得超分辨的效果，相较于之前的成像效果，SDOM可以将分辨率提升到50-60纳米，尺度缩小了一个数量级，在分辨率上有了很大的提升”席鹏提到。

?相较于之前的“一片模糊”(图片中左上角)，SDOM技术提供的成像(右下部分)更加精准、清晰。

同时，席鹏还表示，SDOM技术具有很快的成像速度(最快可达每秒5帧超分辨)，对激发光功率要求也很低(毫瓦量级)，非常适用于活细胞观察。

在具体操作方面，作者将SDOM技术应用在固定细胞(海马神经元的SDOM成像以及哺乳动物细胞的肌动蛋白成像)以及活体酵母细胞中的septin蛋白成像。目前，关于基因组三维结构的研究正在掀起一轮新的热潮，而NPC(核孔复合体)对于染色体在细胞核内的定位及基因组的三维结构非常重要。因此，作者也利用该新技术对NPC进行了偏振超分辨成像。这些图像都预示着SDOM超分辨技术在生命科学领域中巨大的应用前景。

值得一题的是，本工作的算法已经通过Github开源，目的是让更多的科研工作者能够从中受益。

? 2014年诺贝尔化学奖颁给了在超分辨领域做出杰出贡献的(从左至右)埃里克?白兹格、施泰方?海尔和威廉姆?莫纳尔(图片来源：Nobelprize.org)

最后，席鹏表示，从上世纪九十年代中期到现在，每过十年左右，显微技术就会达到一个节点，“从94、95年超分辨概念被提出，到05、06年超分辨迎来了一个爆发式的增长，各种技术频出;再到2014年，诺贝尔化学奖颁给了超分辨领域的三位开创者，各成果也在很多领域得到了应用。但由于过去大多数超分辨技术强烈依赖于染料，这也限制了它们的应用范围。而SDOM技术由于不依赖于特定的荧光染料，因此有望在生物显微中得到进一步的应用。”

目前，国际上正在掀起一系列偏振超分辨的热潮。超分辨的诺贝尔奖得主William E. Moerner(美国化学家，2014年诺贝尔奖得主)利用荧光分子偏振研究了DNA的构象变化;法国科学家Sophie Brasselet等人提出了PolarSTORM技术，结合荧光单分子定位和偏振信息对DNA和肌动蛋白进行了超分辨成像;美国布朗大学Tani课题组则对DNA和F-actin(纤维形肌动蛋白)的偏振进行了动态跟踪。