利用植物生物反应器生产药用蛋白
图spc.int
（生物技术进展，刘培磊、王志兴等）植物生物反应器广义上指以植物悬浮细胞培养或整株植物为工厂大量生产具有重要功能的蛋白，如人或动物的疫苗、抗体和重要的氨基酸等。与微生物和动物生物反应器相比，植物生物反应器具有成本低、安全性好、表达产物具有与高等动物细胞一样的免疫原性和生物活性等优点。
自1986年Barta将激素与农杆菌胆脂碱合成酶进行融合表达，首次使用植物表达系统生产药用相关蛋白，1989年第一次使用烟草表达抗体，1992年第一次使用植物生产乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原以来，利用植物生物反应器生产药用蛋白已成为国际上植物基因工程的一个新的发展趋势。
生产抗体
将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物，即可在植物中表达出具有功能性识别抗原及具有结合特性的全抗体或部分抗体片段。植物细胞不但可以对表达的重组抗体蛋白进行正确的组装和后期加工，其表达产物能保持良好的生物学特性，而且植物表达的抗体以二聚体形式存在，表达产物的亲和力高，有助于全面发挥抗体的功能。1989年，美国医学生物学家Hiatt等从小鼠中克隆了抗体重链和轻链基因，并分别用农杆菌介导法转入烟草，通过有性杂交和筛选鉴定，在后代同一植株中表达出由重链和轻链组装的功能性抗体，抗体量可达烟草叶总蛋白的1. 3%，就此开创了利用植物生产抗体的先河。此后，分泌性抗体、嵌合抗体、完整抗体、scFv片段、Fab 片段和双特异活性scFv 片段等先后成功地在不同植物的不同器官中表达，表达水平通常占总可溶性蛋白的0. 5% - 2%。
截止目前，已经有包括磷酸酯、NP半抗原、神经肽、光敏色素、人肌酸激酶、HSV-2、人的IgG、Topoviruses、癌胚抗原、乙肝表面抗原、血液艾滋病毒、人白细胞介素L-4及L-6、马铃薯淀粉分支酶、狂犬病毒蛋白、单纯疱疹病毒、内肠杆菌毒素A、西尼罗河病毒Hu-E16、人源抗狂犬病毒、汉坦病毒、人端粒酶逆转录酶、膀胱癌及人源抗恒河猴D等20多个完整抗体或各种抗体片段如Fab和scFv，表达这些抗体的植物种类主要包括烟草、马铃薯、大豆、拟南芥、小麦、紫花苜蓿、水稻以及玉米等。具体见表1。
表1利用转基因植物表达的药用重组抗体（2000年以后）
| 时间 | 表达形式 | 抗体/抗原 | 受体植物 |
| 2000 | scFvT84.66 | 癌胚抗原CEA | 豌豆 |
| 2000 | scFvT84.66 | 癌胚抗原CEA | 水稻和小麦 |
| 2001 |
Fab fragment |
人肌酸激酶 |
拟南芥 |
| 2002 | scFv | 乙肝表面抗原 | 烟草 |
| 2002 | scFv2fusion | 血液艾滋病毒 | 烟草、谷物、马铃薯 |
| 2003 | scFv | 人白细胞介素L-4和L-6 | 烟草 |
| 2003 | VHH | 马铃薯淀粉分枝酶 | 马铃薯 |
| 2003 | mAb SO57 | 狂犬病毒蛋白 | 烟草 |
| 2003 | LSC | 单纯疱疹病毒 | 藻类 |
| 2006 | scFv | 内肠杆菌毒素A | 烟草 |
| 2006 | scFv | 人端粒酶逆转录酶单链抗体 | 烟草 |
| 2007 |
scFv
|
抗汉滩病毒鼠源单抗3G1单链抗体 | 拟南芥 |
| 2010 | mAb |
西尼罗河病毒Hu-E16 |
烟草 |
生产疫苗
自从1990年Curtis和 Cardineau 报道利用植物生产疫苗以来，许多人或动物的自身免疫的、病毒的、细菌的、寄生虫的、肠的以及非肠的病原的疫苗通过不同的植物系统得到生产。这些植物系统包括马铃薯、烟草、番茄、生菜、水稻、花生、玉米、拟南芥、西伯利亚参、大豆、胡萝卜、羽扇豆、莴苣、甘蓝、花椰菜、紫花苜蓿、白车轴草、木瓜和樱桃等。目前已有20多种疫苗在植物中得到表达，并且美国Dow Agroscience公司利用烟草生产新城疫病毒的疫苗已批准使用。关于利用植物生产的疫苗具体见表2。
表2利用植物生物反应器生产的重组疫苗（2005年以后）
| 植物 | 病原菌 | 抗原蛋白 | 烟草 | 霍乱病毒 | CTB–InsB3（人胰岛素B链） | 烟草 | 霍乱病毒 | CTB | 烟草 | 霍乱弧菌和猪红斑丹毒丝菌 | CTB–表面保护抗原 (SpaA) | 生菜 | 霍乱病毒 | sCTB–KDEL | 水稻 | 霍乱病毒 | CTB | 花生 | 霍乱病毒和狂犬病病毒 | 霍乱毒素B亚基-狂犬病糖蛋白(RGP) | 番茄 | 霍乱病毒 | CTB-P4/CTB-P6/ TCPA | 水稻 | 霍乱病毒 | CTB | 烟草 | 大肠杆菌 | LTB | 西伯利亚参 | 大肠杆菌 | LTB | 大豆 | 大肠杆菌 | LTB | 胡萝卜 | 大肠杆菌 | LTB | 烟草 | 产生肠毒素的大肠杆菌菌株 (ETEC) | LTB—热稳定毒素 (ST) | 马铃薯 | 猪流行性腹泻病毒 (PEDV) | Neutralizing epitope of PEDV (COE) | 烟草 | 猪流行性腹泻病毒 (PEDV) | Neutralizing epitope of PEDV (CO-26K) |
烟草和番茄 |
HBV | HBsAgM/S和 NVCP | 香蕉 | HBV | HBsAg | 马铃薯 | HBV | HBsAg | 番茄 | HBV | HBsAg-ENV,GAG，HIV-1抗原决定基 | 马铃薯 | HBV | HBsAgM | 拟南芥/烟草 |
乳突淋瘤病毒(HPV)
|
HPV11 L1壳蛋白 | 番茄 | 白喉杆菌，百日咳杆菌和破伤风杆菌 | 百日咳鲍特菌，白喉杆菌，破伤风痉挛毒素抗原决定簇 | 烟草 | 狂犬病病毒 | 狂犬病糖蛋白（RGP） | 番茄 | 狂犬病病毒 | 狂犬病病毒核糖核蛋白(RNP) | 花椰菜 | 牛痘病毒和SARS病毒 | 牛痘病毒B5衣壳蛋白和冠状病毒糖蛋白的抗原决定簇 | 羽衣甘蓝，烟草 | 牛痘病毒 | 牛痘病毒B5衣壳蛋白 | 番茄 | 人类免疫缺陷病毒 (HIV) | HIV-1穿梭蛋白 | 番茄 | 引起神经变性 | 人类B-胶化纤维素(Aβ) | 水稻 | 引起关节软骨炎症 | 二型胶原蛋白肽 | 花生 | 蓝舌病病毒(BTV) | 组成病毒衣壳蛋的基因-VP2 | 木瓜 | 猪肉绦虫 | 合成肽KETc1, KETc12, KETc7 | 烟草 | 禽流感病毒H5/HA1及其变体 | H5/HA1突变体–HDEL | 番茄 | 鼠疫杆菌 | F1-V融合蛋白 | 烟草 | 鼠疫杆菌 | F1-V融合蛋白 | 烟草和拟南芥 | 人体免疫缺陷病毒-1(HIV-1)和乙型肝炎病毒 (HBV) | HIV-1/HBV重组体病毒 | 莴苣 | 鼠疫杆菌 | F1-V | 番茄/烟草 | 霍乱病毒和肝炎B病毒(HBV) | CTB和 HBsAg | 番茄 | 霍乱病毒 | CTB | 番茄 | HBV | PRS-S1S2S | 紫花苜蓿 | 轮状病毒 | 人类A组轮状病毒PBsVP6 | 水稻 |
新城鸡瘟病毒(NDV)
|
新城鸡瘟病毒包裹蛋白和糖蛋白的融合蛋白 | 烟草 |
PRRSV |
GP5蛋白 |
烟草 |
PRRSV |
LTB-GP5 |
其他药用蛋白
生产具有药学活性的植物蛋白和多肽是近年来植物生物反应器应用的另一个迅速发展的领域，例如细胞因子、酶及其他药用蛋白和生物活性肽等。到目前为止，人们已经成功地在植物中表达的蛋白还有胰岛素、干扰素、溶菌酶、人生长激素、人表皮生长因子、人凝血因子、白细胞介素等。表达的宿主植物主要有烟草、马铃薯、拟南芥、玉米、水稻和大豆等（表3）。
表3利用植物生物反应器表达其他药用蛋白（2005年以后）
| 时间 | 表达的蛋白 | 转化植物 |
| 2005 |
胰升糖素样肽 (GLP-1) |
水稻 |
| 2006 |
胰岛素 |
拟南芥 |
| 2006 |
基本成纤维细胞生长因子 |
大豆 |
| 2006 |
人骨形态发生蛋白-2 |
烟草 |
| 2006 |
人凝血Ⅸ因子基因HFⅨ |
烟草 |
| 2006 |
巨噬细胞集落刺激因子 |
烟草 |
| 2007 |
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ hGM-CSF） |
水稻 |
| 2007 |
人表皮生长因子 |
烟草 |
| 2007 |
人凝血Ⅸ因子 |
番茄果实 |
| 2008 |
人α-1抗胰蛋白酶 |
番茄 |
| 2010 |
人生长激素 |
大豆种子 |
| 2011 |
人阿扑脂蛋白 |
烟草 |
| 2011 |
阿扑脂蛋白 |
红花 |
| 2011 |
人干扰素α-2b |
胡萝卜 |
药用工业用转基因植物的研发阶段
经过近20多年的研究，目前已有部分植物生产的药用蛋白进入市场，部分产品进入临床试验阶段，如Hood等在转基因玉米中成功表达了重组抗生物素蛋白,表达量占总可溶性蛋白的2%,现已成为Sigma-Aldrich的商品。转基因油菜种子油体中表达的水蛭素已经在加拿大投入商业生产。到目前为止，已有9个重组蛋白已进入原料或试剂市场，6个已批准在临床上应用，3个处于临床研究III期，5个处于临床研究II期，16个处于临床研究I期。具体见表4：
表4 药用转基因植物的临床应用
|
公司名称 |
产品 |
用途 |
宿主植物 |
阶段 |
|
Planet Biotechnology Inc.美国 |
单克隆抗体CaroRxTM |
预防龋齿 |
烟草 (田间生长) |
欧盟批准 (人用) |
|
Dow AgroSciences，美国 |
Newcastle病毒的HN 蛋白 |
Newcastle疾病 |
烟草 (细胞培养) |
USDA 批准 |
|
Cobento As ，丹麦 |
人乳铁蛋白, 人溶菌酶 |
维生素B12缺乏 |
拟南芥 (温室) |
欧盟批准 (人用) |
|
CIGB ，古巴 |
乙肝抗体 |
乙肝 |
烟草(温室) |
上市 |
|
Ventria Bioscience，美国 |
人溶菌酶 |
工业用 |
水稻 |
上市 |
|
Ventria Bioscience，美国 |
人乳铁蛋白 |
工业用 |
水稻 |
上市 |
|
SemBiosys，加拿大 |
ImmunosphereTM |
虾饲料添加剂 |
红花 |
上市 |
|
ORF Genetics，冰岛 |
ISOkineTM, DERMOkineTM |
人生长因子 |
大麦 |
上市 |
|
Meristem Therapeutics，法国 |
胃脂肪酶 |
囊性纤维化 |
玉米 |
上市 |
|
Protalix Biotherapeutics，以色列 |
人葡糖脑苷脂酶（prGCD） |
Gaucher疾病 |
胡萝卜悬浮细胞 |
等待USDA批准 |
|
BioProcessing LLC，美国 |
Aprotinin |
Reduction of systemic inflammation due to cardiopulmonary bypass surgery |
Tobacco (Greenhouse) |
Already sold for non-clinical use, clinical status |
|
Ventria Bioscience，美国 |
人溶菌酶 |
痢疾 |
水稻 |
完成临床第三阶段，等待FDA 批准 |
|
SemBiosys，加拿大 |
胰岛素 |
糖尿病 |
红花 |
临床III |
|
Bayer I nnovation，美国 |
个人疫苗 |
非霍奇金淋巴瘤 |
烟草 |
临床III |
|
Arizona State University，美国 |
乙肝疫苗抗原 |
乙肝 |
土豆 |
临床II |
|
Large Scale Biology Crop,美国 |
癌症疫苗 |
非霍奇金淋巴瘤 |
烟草 |
临床II |
|
Biolex Therapeutics ，美国 |
LactoferronTM(α干扰素) |
乙肝和丙肝 |
浮萍 |
临床II |
|
Guardian biosciences，美国 |
家禽疫苗 |
球虫病感染 |
油菜籽 |
临床II |
|
Planet Biotechnology Inc.，美国 |
RhinoRxTM |
感冒 |
烟草 |
临床II |
|
Planet Biotechnology Inc.，美国 |
ICAM-1 抗体融合蛋白 |
普通感冒 |
烟草 |
临床I |
|
Planet Biotechnology Inc.美国 |
DoxoRxTM 抗体 |
癌症治疗引起的副作用 |
烟草 |
临床I期完成 |
|
Large Scale Biology，美国 |
Fv抗体 |
非霍奇金淋巴瘤 |
烟草 |
临床I |
|
Planet Biotechnology Inc.美国 |
α半乳糖苷酶 |
Fabry疾病 |
烟草 |
临床I |
|
Biolex，美国 |
纤溶药物 |
血凝 |
浮萍 |
临床I |
|
SemBioSys,加拿大 |
载脂蛋白 |
心血管 |
红花 |
临床I |
|
Medicago，USA |
H5N1疫苗 |
H5N1流感 |
烟草 |
临床I |
|
ProdiGeneb，USA |
胃肠炎病毒衣壳蛋白 |
仔猪胃肠炎 |
玉米 |
临床I |
|
Dow Agro Sciences，USA |
病毒性疫苗混合物 |
马、狗和鸟的疾病 |
烟草悬浮细胞 |
临床I |
|
ProdiGene b，USA |
大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位 |
腹泻 |
玉米 |
临床I |
|
Arizona State University，美国 |
大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位 |
腹泻 |
土豆 |
临床I |
|
Arizona State University |
霍乱弧菌 |
霍乱 |
土豆 |
临床I |
|
Arizona State University，美国 |
Norwalk 病毒衣壳蛋白 |
腹泻 |
土豆 |
临床I |
|
Arizona State University，美国 |
Norwalk 病毒衣壳蛋白 |
腹泻 |
番茄 |
临床I |
|
Thomas Jefferson University，USA |
乙肝疫苗抗原 |
乙肝 |
莴苣 |
临床I |
|
Thomas Jefferson University，USA |
融合蛋白（包括狂犬病抗原表位） |
狂犬病 |
菠菜 |
临床I |
问题及展望
目前尚存在目标蛋白表达量低、目标蛋白提取纯化成本较高、转基因产品的安全性等问题。目标蛋白表达量低是当前利用植物生物反应器生产药用蛋白中普遍存在的问题，研究者们正在试图通过优化外源基因的调控序列、特定部位表达、使用植物病毒表达载体等方式来提高目标基因的表达量。
利用植物生物反应器生产药用蛋白虽然上游成本比动物生物反应器要低，但是从植物中提取纯化目标蛋白的成本很高，从而增加了利用生物反应器生产药用蛋白的总体成本。通过选择适当的受体材料可以有效避免由于纯化目标蛋白而增加成本的问题。例如利用香蕉作为受体材料表达食用疫苗，不但可以避免高成本纯化目标蛋白，而且可以满足人们对经济疫苗的需求。利用种子表达系统或植物细胞的悬浮培养也都能有效的避免因为下游产品加工而引起的成本增加问题。
利用植物生物反应器生产药用蛋白的安全性问题一直是人们关注的焦点问题。由于其目标蛋白的特殊性，必须采取有效措施保证这类特殊用途的转基因植物不能进入食物链。现在研究者们在培育药用转基因植物的初期，就充分考虑其安全性，利用现有技术和一些特殊的标记基因（如红色荧光蛋白），使得这类转基因产品很容易被识别，从而避免这类药用转基因植物中外源基因向环境中的逃逸，保证其安全性。
总之，随着生物技术的发展，新的高效调控元件不断发掘，新的表达体系、转化系统和新技术的不断建立，相信在不久的将来，目前存在的这些问题都会迎刃而解，利用植物生物反应器生产药用蛋白将具有更加广泛的应用前景，带来巨大的经济和社会效益。
