CRISPR/Cas9基因组编辑技术实现对产乙醇梭菌的编辑

近期Biotechnology for Biofuels期刊在线发表了利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术编辑产乙醇梭菌基因组相关的工作，该工作首次实现了用CRISPR/Cas9技术编辑产乙醇梭菌基因组，并且开发出一个表达cas9蛋白的诱导型启动子库，提高了编辑效率。

产乙醇梭菌及CRISPR/Cas9

产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）是一种自产乙酸的模式菌种，工业生产中以其为底盘细胞生产乙醇、2，3-丁二醇等一些大宗化学产品。在该菌种基因组编辑相关的工作之前已有报道，但是由于所用的方法不能实现无痕操作，且耗费时间，于是迫切需要开发出一种新的遗传操作工具来实现快速、高效对产乙醇梭菌进行相关的遗传操作。

CRISPR基因组编辑技术是近几年全球风靡的一种基因组编辑技术，被人们称为第三代基因组编辑技术，其中以CRIPSR/Cas9运用最为广泛，该工具的操作核心为：利用一个小的（150bp左右）的gRNA靶定基因组上的某个所要编辑的位点，然后引导cas9蛋白结合上去，cas9中的两个核酸内切酶对基因组形成DSB，然后再利用相关的机制进行修复。在真核细胞中在没有外源导入同源臂（donor）时利用NHEJ的机制进行修复，如果有认为导入的同源臂，则可能以同源重组的方式对切割的位置进行修复。而原核生物几乎都利用同源重组的方式进行修复。于是在本研究中需要认为的导入同源臂来进行修复。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术实现对产乙醇梭菌的基因组编辑

本研究利用CRISPR/Cas9实现了对产乙醇梭菌基因组进行相关的编辑，研究者在产丁醇中建立的CRISPR/Cas9系统的模式类似中科院植物生理生态研究所杨晟研究员2015在Applied and Environmental Microbiology期刊上发表的在大肠中CRISPR/Cas9的研究成果(Jiang et al., 2015)。将sgRNA与同源臂安装于一个质粒上，另外的Cas9蛋白安装于另外一个质粒，双质粒系统构成该工作的CRISPR/Cas系统 (Nagaraju et al., 2016)。

在该工作中，研究者利用内源的组成型启动子控制cas9蛋白表达多次尝试没有成功，考虑其原因可能是cas9组成性表达毒性。于是研究利用了一个四环素诱导型的启动控制cas9表达，经过这样的变化后导入cas9质粒可以工作，这样改工作的基本框架已经形成。

Cas9表达的控制、优化提高CRISPR/Cas9在产乙醇梭菌中的编辑效率

研究者初始构建的CRISPR/Cas9系统的编辑效率较低且基因存在部分敲除的问题，为了解决这些问题，研究者做了两项改进：控制cas9的表达；使编辑基因的一端同源臂尽量靠近cas9的切割位点。

研究建了一个小型诱导型启动子库，用于cas9的表达。经过最后的启动子库内的筛选，得到一个最强的诱导型启动子（IPL12），利用该启动子来控制cas9的表达。

经过上述两个地方的改进，该系统的效率提高了至少50%。

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