青岛能源所崔球研究组在梭菌遗传改造生产纤维素乙醇研究取得

中科院青岛生物能源与过程研究所崔球研究组利用热纤梭菌和解纤维梭菌研究利用微生物生产纤维素乙醇方面获得新进展。相关成果分别发表在J. Microbiol. Methods、Appl Microbiol Biotechnol和PLoS ONE上。

热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)是能够降解纤维素生产乙醇的产纤维小体梭菌，可通过整合生物加工技术(CBP)实现木质纤维素糖化，是生产纤维素乙醇的候选微生物，在生物燃料工业生产中具有巨大潜力。现有可用于生物乙醇生产的野生菌具有株抗逆性低、碳谱窄或乙醇产量低等缺点，均需要进行系统的代谢工程改造，以适应工业化生产需要。

近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所代谢物组学团队负责人、中科院“百人计划”入选者崔球研究员等以热纤梭菌和解纤维梭菌为嗜高温和嗜中温的模式菌株，在可靠的合成生物学遗传改造工具箱开发及其在纤维素乙醇合成中的应用方面取得了一系列新进展。

图1. 自主研发基因导入仪及厌氧工作站

图2. 解纤维梭菌中遗传改造工具的建立。

A，不依赖于氧气的荧光蛋白PpFbFP在热纤梭菌C. thermocellumDSM1313中的表达。B，H10ΔmspI底盘细胞的构建及验证。C， 利用基于PyrF的双向筛选系统两步法获得目标突变株并完成质粒丢失。

图3. 热纤梭菌遗传改造工具开发及乙醇合成代谢工程改造。

A，耐热二类内含子示意图。B，代谢工程改造路线及以纤维二塘或微晶纤维素为底物的发酵终产物(乳酸、乙酸和乙醇)分析。

稳定的DNA转化方法和较高的转化效率是遗传改造的前提。该团队自主研发了新一代基因导入仪以及厌氧工作站(图1)，对热纤梭菌和解纤维梭菌的电转化条件进行优化，获得了稳定的转化方法，并使转化效率从102/ μg DNA提高到104/ μg DNA，为基因工程改造奠定了基础。通过为两菌种建立的质粒骨架系统，并利用不依赖于氧气的荧光蛋白在菌株中实现表达，建立了荧光蛋白报告系统，为外源基因在梭菌中的表达提供了检测方法(图2A)。

梭菌的靶向基因敲除工具主要是通过ClosTron方法实现的，而该方法在解纤维梭菌中的应用存在遗传改造工作效率低、无法实现快速的多基因连续敲除等问题。为此，该团队敲除了解纤维梭菌的MspI编码基因，获得了一个无需甲基化修饰的底盘菌株(图2B)，从而提高了遗传操作效率(J. Microbiol. Methods. 2012. 89(3):201-8)。为实现快速的多基因连续敲除，该团队还开发了一套基于PyrF的双向筛选系统(图2C)，配合ClosTron方法使用，能够有效促进解纤维梭菌转化子中质粒的丢失，极大的缩短了系统基因工程改造周期。(Appl Microbiol Biotechnol online. doi:10.1007/s00253-013-5330-y)

由于目前已有的targetron技术无法应用于嗜热微生物的遗传改造，该团队还与美国科学院院士Alan M. Lambowitz教授(美国特克萨斯大学奥斯汀分校)合作，利用源于一株嗜热蓝细菌Thermosynechococcus elongatus的二类内含子Tel3c4c (图3A),构建了一套基于耐热性靶向内含子Thermotargetron的高效、便捷的多基因靶向敲除系统，并成功应用于热纤梭菌这一重要工业高温微生物的代谢工程改造(图3B)，为木质纤维素利用及纤维素乙醇的工业生产提供了有力的技术支持。研究开发的Thermotargetron耐热性二类内含子系统也可以应用到其他嗜热微生物的基因工程改造中，具有广泛的应用价值。(PloS One 8(7):e69032)

上述工作获得了科技部“973计划”、“863计划”、中科院“百人计划”和院科研装备项目资助，研究开发的一系列针对嗜中温和嗜高温梭菌的遗传改造工具，将为其在生物燃料及相关化学品的工业生产中得到广泛应用提供重要的技术支持。