方舟子：基因序列是怎么巧妙测出来的

图csiro.au

（方舟子，《新华每日电讯》2013.11.29）11月19日，英国著名生物化学家弗雷德里克·桑格在睡梦中去世，享年95岁。在学生物出身的人当中，桑格是一个尽人皆知的传奇式人物，传奇到很多人听到他的死讯时，都很惊讶他还活着。他一个人解决了现代生物学的两大实际难题：怎么测定蛋白质的序列和怎么测定DNA（脱氧核糖核酸）的序列。因此他两次获得诺贝尔奖，在历史上，只有四个科学家有此殊荣（其中一个——美国化学家鲍林——第二次获得的还是没有含金量的和平奖），而桑格是最后一个。1955年，桑格测定了第一种蛋白质（牛胰岛素）的序列和结构，3年后因此获得诺贝尔奖化学奖。1977年，桑格发明了一种快速测定DNA序列的巧妙方法，3年后再次获得诺贝尔化学奖。桑格发明的DNA测序方法很快成为各个分子生物学实验室的常规方法，成为最常用的测序方法达20多年之久（人类基因组序列就是用这种方法测定的），一直到现在，在小规模的DNA测序中还在使用。

现在的生物系研究生已经不需要自己去测DNA序列了，只需把DNA样品交给负责测序的技术人员，自动测序仪很快就会报出结果。我这一代的研究生，则要自己动手测序，掌握手工测序技术是基本功，跑出一个漂亮的“测序胶”，是一项技术活。测序也是分子生物学实验中最有意思的部分，所以现在的学生不再自己测序，真是失去了不少乐趣。实验第二天，取出测序胶辐射感光的底片，对着灯光依次读出底片上一条条黑带，一一记录下来：A、T、G、C……就仿佛又亲手破译了一小段生命的奥秘。

生命的奥秘，或者说遗传的信息，就隐藏在DNA的序列中。DNA是一种很长很大的分子，它是由四种脱氧核苷酸链接而成的，这四种脱氧核苷酸分别简称A、T、G、C。这四种脱氧核苷酸的排列组合，就构成了DNA序列，所谓测序，就是要知道某一段DNA上的核苷酸是怎么排列的。在正常状态下，DNA是由两条链组成的，这两条链的序列存在着互补：如果一条链上某个位置上是A，另一条链上的同一位置就是T，如果是G，对应的就是C。所以只要测定了一条链的序列，根据A对应T，G对应C的互补原则，就可以知道另一条链的序列。在细胞准备分裂、需要复制遗传信息时，DNA的两条链解开变成两条单链，然后分别以这两条单链为模板，根据互补的原则，合成出另一条链。这个复制过程，需要三样的东西，一样是三种脱氧核苷酸作为原料，一样是能把脱氧核苷酸链接起来的DNA聚合酶，但这种酶不能从头开始复制，需要前面已经有了一小段和模板结合的DNA作为复制的起点（叫做引物），然后才能往上加新的脱氧核苷酸，所以最后一样需要的东西是引物（在细胞中，引物是由不需要引物的另一种酶合成的）。

桑格就是巧妙地利用了DNA复制机理来测定序列的。桑格的巧妙之处在于，除了上述三样东西，他给增添了一样东西：四种双脱氧核苷酸，它们在脱氧核苷酸A、T、G、C的基础上又少了一个氧原子（分别标记为ddA、ddT、ddG、ddC），它们能够根据互补的原则加到DNA链上，但是由于少了一个氧原子，没法再加核苷酸了，所以复制就到此为止。

好了，现在可以开始测序了。把要测序的DNA样品分成四份，每一份都加上A、T、G、C、DNA聚合酶和引物（实验用的引物是用化学方法合成的一小段DNA作为复制的起点，要合成它需要知道它有什么样的序列。你可能会奇怪，还没测序呢，怎么知道引物的序列？这是因为要测序的DNA是用分子克隆技术插进载体DNA中的，载体DNA的序列是已知的，可以根据载体DNA序列设计引物，最后测序的结果实际上是前面有一段载体DNA序列，后面才是我们要的DNA序列）。再给每一份样品分别加上一种双脱氧核苷酸，例如第一份加ddA，第二份加ddT，第三份加ddG，第四份加ddC。然后在一定条件下让它们开始复制DNA。我们假定DNA模板的第一个核苷酸是T，复制时与它互补的应该是A，在第一份样品中有ddA，如果跟T互补的是ddA，那么这条链的复制就终止，得到的是最小的一个片段；如果结合上去的是A，复制就继续下去，直到又碰到一个T，再次出现是ddA还是A的选择……依次类推，在第一份样品中，复制的结果得到的是一条条以ddA为终端的不同长度的DNA链，第二份以ddT为终端，第三份以ddG为终端，第四份以ddC为终端。把四份样品中的新DNA链综合起来看，就是一条条长短不一的DNA片段，每个不同片段的长度只差一个核苷酸，那么，如果能把这些DNA片段从短到长依次排列，看它们最后一个核苷酸是什么样的，依次记下来，不就是我们想要的DNA序列了吗？

这时候就需要跑“测序胶”了。把四份样品并排分别加到凝胶中，通上电。DNA分子带负电，在电场的作用下，在凝胶中DNA片段向正极方向跑，短的DNA片段跑得快，长的DNA片段跑得慢，这样，不同长度的DNA片段就可以在凝胶中一一分开，处于不同的位置上。然后把凝胶烘干，覆盖上底片。为了能看出DNA片段所在的位置，实验用的核苷酸是用放射性同位素做了标记的，它们能够发出射线让底片感光。第二天，取出底片冲洗，可以看到上面有一条条小小的黑带表示不同DNA片段所在的位置。从跑得最快的那条黑带开始找起，如果它是来自第一份样品的，写下A。再找第二快的黑带，如果是来自第三份样品的，写下G。再找第三快的黑带，看它是来自哪份样品的……这样找下去，一一记下来，比如：AGTTACC……这就是我们想知道的DNA序列。

在桑格同时和之后，还有别人发明别的DNA测序方法，有的已取代桑格方法用于大规模测序。但是没有哪一种测序方法像桑格方法那样让人有耳目一新、恍然大悟的惊艳之感。1991年我初到美国留学时，全校外国研究生集中培训，为带本科生的课做准备。培训快结束时，要求每个人上台科普一项本学科知识。我当时正忙于测序（还因为测序的工作，在一篇发表在英国《自然》的论文上挂名），就上台讲了桑格测序法。其他系的研究生居然也听得津津有味，有人还感叹道：“能想到这个方法的人，真是个天才！”然而，在他留下的唯一篇自传（写于1988年）中，桑格却说：“和我多数的科学同行不同，我在学术方面并不聪颖。我从未获得过奖学金，如果我的父母不是相当富裕的话，我很可能上不了剑桥大学；不过，在那些实验非常重要以及相当狭窄的专门知识很有用处的研究领域，我努力让自己与学术上最优秀的人并驾齐驱。”1983年，桑格65岁时他决定退休，回家当园丁，因为他觉得发明DNA测序法是他所能达到的顶峰，再继续从事科研已没有意义。