郁金香主要病毒的分子检测研究

本研究以新疆郁金香种植区植株和进口种球为材料，利用特异性引物，对侵染郁金香的主要病毒黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的一步法RT-PCR分子检测技术进行了初步研究。根据两种病毒的基因序列，合成了两对特异性引物，并对RT-PCR中的引物浓度、退火温度和反应循环数等因素进行了筛选和优化。研究显示，阳性对照和带病毒植株均扩增出了与预期大小一致的特异性条带，而健康植株无任何扩增产物。一步RT-PCR的最佳反应体系为：模板RNA 1 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，上、下游扩增引物各1 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL，加RNase Free ddH2O至50 μL。黄瓜花叶病毒(CMV)和碎色病毒(TBV)特异性引物的最佳反应程序：cDNA合成50℃ 30 min；预变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火(CMV)56℃/(TBV)52℃ 30 s，然后72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。实验表明，种植区内栽培一年的郁金香植株部分已被CMV和TBV侵染，其中还有复合侵染的现象存在。本研究建立了基于核酸水平的高灵敏度的一步RT-PCR法郁金香病毒检测技术，能准确的检测出植株中的TBV和CMV，适用于郁金香黄瓜花叶病毒(CMV)、碎色病毒(TBV)的鉴定和检测，为脱毒组培苗的检测和脱毒体系的建立提供理论依据和技术支撑。